李三和　韓光明　閘雯俊　劉凱　胡剛　游艾青

摘要：以水稻（Oryza sativa L.）秈型兩系恢復(fù)系M5274和晚粳稻不育系N55S成熟胚為材料，以攜帶有雙元載體的根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105為載體進(jìn)行抗飛虱基因Bph14、Bphi008A、Osgl的遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得515棵再生植株，包括198株Bph14轉(zhuǎn)基因植株、72株Bphi008A轉(zhuǎn)基因植株和245株Osz！轉(zhuǎn)基因植株。PCR檢測(cè)結(jié)果表明，獲得的515株再生植株中，有244株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，3個(gè)不同抗褐飛虱基因中，轉(zhuǎn)Bvh14基因的再生苗陽(yáng)性率最高，增加篩選次數(shù)能有效減少轉(zhuǎn)化所得的假陽(yáng)性植株。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）介導(dǎo)轉(zhuǎn)化；抗褐飛虱基因

中圖分類號(hào)：S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）09-2392-04

近年來，褐飛虱遷入中國(guó)的蟲量大，由于目前大多數(shù)水稻（Orvza sativa L.）品種不抗蟲，尤其是一些主要的雜交稻品種，對(duì)褐飛虱等蟲害還有“超感蟲性”（hyper-susceptibility）。目前，水稻褐飛虱已經(jīng)成為一種爆發(fā)力強(qiáng)、對(duì)水稻危害性極大的蟲害。由于褐飛虱的危害多發(fā)生在水稻成熟灌漿期，此時(shí)若大量使用殺蟲劑，對(duì)水稻的污染會(huì)非常嚴(yán)重，這也是中國(guó)水稻生產(chǎn)中迫切需要解決的重要問題。研究證明，利用抗褐飛虱基因培育抗蟲水稻品種是褐飛虱綜合防治中經(jīng)濟(jì)有效的方法。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合培育抗褐飛虱水稻品種，有效控制褐飛虱的發(fā)生與危害，可確保中國(guó)水稻生產(chǎn)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展和國(guó)家糧食安全。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是對(duì)天然載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的一種模仿，已在水稻轉(zhuǎn)基因育種及功能基因組研究中被廣泛應(yīng)用，1994年以后，由于技術(shù)上的突破。相繼在不同水稻品種中獲得成功，轉(zhuǎn)化效率也大大提高，如粳稻的轉(zhuǎn)化率一般在30%左右，最高可達(dá)到64.6%。本研究以育種上應(yīng)用的典型秈型兩系恢復(fù)系M5274和晚粳稻不育系N55S為材料，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)褐飛虱抗性基因Bph14、Bphi008A、Osgl進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，目的是通過3個(gè)抗褐飛虱基因的導(dǎo)入，探索水稻抗褐飛虱育種的新途徑，以期提高其產(chǎn)量和品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 植物受體材料

兩系恢復(fù)系M5274、晚粳稻不育系N55S，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所選育。

1.2 農(nóng)桿菌菌株與質(zhì)粒載體

根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，質(zhì)粒PCAMBIA1300的T-DNA區(qū)含有潮霉素抗性基因（Hyg^r），抗褐飛虱基因Bph14、Bphi008A、Osgl由武漢大學(xué)提供。

1.3 材料的處理及接種

選取健康飽滿無病斑的成熟種子，除去穎殼，用75%乙醇浸泡1min，然后將種子置于新配制的0.1%氯化汞溶液中，攪拌10-12min。滅菌后用無菌水沖洗4-5次，最后將種子取出置于無菌濾紙上，待種子表面干燥后，以平擺法將其接種于各自不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶12-14粒。每個(gè)品種接30瓶。

1.4 水稻組織培養(yǎng)

粳稻組織培養(yǎng)培養(yǎng)基見表1，秈稻組織培養(yǎng)基為L(zhǎng)Y培養(yǎng)基，購(gòu)自武漢博遠(yuǎn)生物科技有限公司。將成熟胚表面按“1.3”的方法消毒后接種于愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.5 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及其介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化

根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過程參照Hiei等的方法。

1）劃菌：取轉(zhuǎn)化后經(jīng)檢測(cè)有所需載體的農(nóng)桿菌保存菌液5-10μL，至YEB（加入濃度為100mg/L的卡那霉素）的固體培養(yǎng)基上涂板，30℃黑暗培養(yǎng)，直到長(zhǎng)出單菌落。將單菌落二次劃線培養(yǎng)農(nóng)桿菌24-36h，刮菌體于懸菌培養(yǎng)基中，30℃180r/min搖菌3-4h，調(diào)整菌液OD_600nm至所需值。

2）侵染：用懸浮培養(yǎng)基稀釋菌液，直到OD_600nm為0.1-0.9，將含農(nóng)桿菌菌液倒入已放好愈傷的培養(yǎng)瓶中，根據(jù)菌液濃度在30℃搖床上侵染5-30min。倒掉菌液，用滅菌的濾紙將菌液吸干，用鑷子把愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，20℃黑暗培養(yǎng)48-72h。

3）洗菌：把共培養(yǎng)基上的愈傷組織轉(zhuǎn)入滅菌三角瓶中，用無菌水清洗5-6次，直到水不再渾濁。然后加入滅菌水（含有500mg/L頭孢霉素）120r/min28℃搖菌15-20min。

4）晾干愈傷：把水倒掉，把愈傷組織轉(zhuǎn)移到放有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，在超凈臺(tái)吹40-50min。

5）把晾干的愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，分別進(jìn)行一輪和兩輪篩選培養(yǎng)。每輪25d左右，比較篩選的有效性。

6）把篩選出的抗性愈傷組織進(jìn)行預(yù)分化、分化和生根培養(yǎng)。

1.6 轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR鑒定

1.6.1 轉(zhuǎn)基因植株總DNA的提取 按CTAB法從水稻新鮮葉片中提取總DNA。

1.6.2 潮霉索抗性基因的PCR檢測(cè) 根據(jù)轉(zhuǎn)化載體中Hyg^r基因DNA片段的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR引物為Primer1（5'-GCCTGACCTATTG-CATCTCC-3'）、Primer2（5'-CCTCGCTCCAGTCAAT-GACC-3'）。PCR反應(yīng)體系：總體系為20txL，DNA模板50ng，10xbuffer2，0μL，2mmol/L dNTP1.5μL，25mmol/L MgCl₂2.0μL，10μmol/L引物各0.4μL，Taq酶1U。加滅菌ddH₂O至20μL。PCR反應(yīng)程序：94℃變性3min：94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，35個(gè)循環(huán)：72℃延伸5min。

1.6.3 目的基因Bph14的檢測(cè) 根據(jù)Bph14基因序列設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)水稻的基因組DNA中是否含有該基因。PCR擴(kuò)增引物：正向5-GGCAGATCATCACCAACTCC-3，反向5-GGCGACTGCGAATGCTAT-3，產(chǎn)物大小為566bp。PCR反應(yīng)體系：總體系為20μL，DNA模板50ng，10×buffer2.0×L。2mmol/LdNTP1，5μL，25mmol/LMgCl₂2.0×L，10μmol/L引物各0.4μL，Taq酶1U，加滅菌ddH₂O至20μL。PCR反應(yīng)程序：94℃。變性5min：94℃，變性1min。58℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)：72℃延伸5min。

2 結(jié)果與分析

2.1 粳稻N55s轉(zhuǎn)基因植株的獲得

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)粳型稻N55S只進(jìn)行第一輪篩選后，分化生根，獲得轉(zhuǎn)Bph14基因的總苗數(shù)為40株，陽(yáng)性株數(shù)21株，陽(yáng)性植株比率為52.5%：獲得轉(zhuǎn)Bphi008A基因的再生苗16株，其中抗性植株5株，陽(yáng)性植株比率為31.3%：獲得轉(zhuǎn)Osgl基因的再生苗35株，其中陽(yáng)性植株12株。陽(yáng)性植株比率為34.3%。進(jìn)行兩輪篩選后。分化生根。獲得轉(zhuǎn)Bph14基因總苗數(shù)為45株，其中陽(yáng)性植株27株，陽(yáng)性植株比率為60.0%：獲得轉(zhuǎn)Bphi008A基因總苗數(shù)22株，其中陽(yáng)性株數(shù)為8株，陽(yáng)性植株比率為36.4%：獲得轉(zhuǎn)Osgl基因總苗數(shù)94株，其中陽(yáng)性植株36株，陽(yáng)性植株比率為38v3%（表2）。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)粳型稻N55S轉(zhuǎn)抗褐飛虱基因的結(jié)果表明，不論是一輪篩選還是兩輪篩選，Bph14基因轉(zhuǎn)化效率最高，Bphi008A基因轉(zhuǎn)化效率最低，Osgl基因轉(zhuǎn)化效率居中，但Bphi008A基因與Osgl基因轉(zhuǎn)化效率相差不大。

2.2 秈稻M5274轉(zhuǎn)基因植株的獲得

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)秈型稻M5274經(jīng)第一輪篩選后，分化生根，獲得轉(zhuǎn)Bph14基因總苗數(shù)46株，陽(yáng)性株數(shù)35株，陽(yáng)性植株比率為76.1%：獲得轉(zhuǎn)Bphi008A基因26株轉(zhuǎn)基因苗，其中抗性植株2株，陽(yáng)性植株比率為7.7%；獲得轉(zhuǎn)Osgl基因19株轉(zhuǎn)基因苗，陽(yáng)性植株6株，陽(yáng)性植株比率為31.6%。第二輪篩選后，獲得轉(zhuǎn)Bph14基因再生苗數(shù)為67株，其中陽(yáng)性植株55株。陽(yáng)性植株比率為82.1%：獲得轉(zhuǎn)Bphi008A基因再生苗數(shù)8株，其中陽(yáng)性株數(shù)為2株。陽(yáng)性植株比率為25.0%：獲得轉(zhuǎn)Osgl基因再生苗97株，其中陽(yáng)性植株35株，陽(yáng)性植株比率為36.1%（表3）。與前面結(jié)果類似，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)秈型稻M5274轉(zhuǎn)抗褐飛虱基因試驗(yàn)中，增加篩選可以提高獲得陽(yáng)性再生苗的比例，且Bph14基因轉(zhuǎn)化效率最高。其次是Osgl基因，Bphi008A基因轉(zhuǎn)化效率最低。

2.3 PCR檢測(cè)

為了獲得轉(zhuǎn)基因的直接證據(jù)，提取了轉(zhuǎn)基因植株的葉片總DNA，除了進(jìn)行了PCR擴(kuò)增檢測(cè)潮霉索抗性基因Hyg^r外。部分轉(zhuǎn)化Bph14基因的材料還檢測(cè)了目的基因。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株中均能擴(kuò)增到566bp潮霉素抗性基因Hyg^dr的DNA條帶，呈陽(yáng)性反應(yīng)，而未轉(zhuǎn)基因植株則沒有擴(kuò)增到DNA條帶（圖1），從而證明目的基因已整合到轉(zhuǎn)基因植株中。

3 討論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)是水稻基因轉(zhuǎn)化的首選方式。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)化效率高。轉(zhuǎn)基因重排比例少，插入拷貝數(shù)少。單拷貝數(shù)植株比例高。影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的因素有菌株類型、水稻基因類型、培養(yǎng)基成分組成、組織培養(yǎng)條件等。不同水稻品種需要不同的轉(zhuǎn)化條件，愈傷組織經(jīng)過多代培養(yǎng)后易產(chǎn)生體細(xì)胞突變，不利于轉(zhuǎn)化體的篩選：同時(shí)，多代培養(yǎng)后愈傷組織衰老死亡，轉(zhuǎn)化效率降低。作者曾將未經(jīng)繼代培養(yǎng)的愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化效率也很低，這說明細(xì)胞的周期狀態(tài)影響轉(zhuǎn)化效率。已有研究表明，當(dāng)愈傷組織處于細(xì)胞周期S期和G2期的比例最高時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高，S期是細(xì)胞DNA復(fù)制期。此時(shí)轉(zhuǎn)化有利于轉(zhuǎn)入的T-DNA鏈轉(zhuǎn)變成雙鏈，增加遺傳和整合的穩(wěn)定性。黃紅梅等研究結(jié)果表明，愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)6-7d后轉(zhuǎn)化率高達(dá)95%，本研究通過已優(yōu)化的粳稻培養(yǎng)基體系和秈稻培養(yǎng)基試劑盒分別對(duì)粳稻N55S和秈稻M5274進(jìn)行抗褐飛虱基因根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，其中粳稻和秈稻轉(zhuǎn)化效率分別為42.5%和45.5%，但3種抗褐飛虱基因?qū)竞投i稻的轉(zhuǎn)化效率不同，其中Bph14最高，Bphi008A最低，Osgl居中。粳稻和秈稻各自不同時(shí)期轉(zhuǎn)化效率的差異可能和組織培養(yǎng)條件和抗褐飛虱基因有密切關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。