楊　歌,　魏　強(qiáng),　趙新穎,　屈　鋒

(1. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院, 北京 100081; 2. 北京市理化分析測(cè)試中心, 北京 100089)

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蛋白質(zhì)的核酸適配體篩選的研究進(jìn)展

楊歌1,魏強(qiáng)1,趙新穎2,屈鋒*

(1. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院, 北京 100081; 2. 北京市理化分析測(cè)試中心, 北京 100089)

摘要:核酸適配體是通過指數(shù)富集系統(tǒng)配體進(jìn)化(SELEX)篩選獲得的,與靶標(biāo)具有高親和力和特異性結(jié)合的單鏈DNA或RNA。蛋白質(zhì)是生命進(jìn)程中的關(guān)鍵功能分子。近年來,以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的適配體篩選在蛋白質(zhì)相關(guān)的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。核酸適配體應(yīng)用性能的優(yōu)劣取決于其親和力、特異性與穩(wěn)定性。目前,適配體篩選方法的優(yōu)化主要是提高篩選效率、提升適配體性能及降低篩選成本。適配體主要篩選步驟包括復(fù)合物分離、核酸庫(kù)優(yōu)化、次級(jí)庫(kù)的富集、適配體序列分析以及親和力表征等。迄今為止,以蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物的分離為核心步驟的適配體篩選方法有20余種。本文歸納總結(jié)了2005年以來以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的適配體篩選技術(shù),討論了各方法的缺陷與局限。介紹了核酸庫(kù)的設(shè)計(jì)優(yōu)化方法、適配體的序列特征,以及常用的親和力表征方法。

關(guān)鍵詞:核酸適配體;蛋白質(zhì);篩選;指數(shù)富集系統(tǒng)配體進(jìn)化;綜述

核酸是生物遺傳信息的載體,其線性信息通過轉(zhuǎn)錄、翻譯、合成等過程最終形成在生物體及生物過程中行使重要功能的具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。此外,生物體內(nèi)普遍存在核酸與蛋白質(zhì)間的相互作用,如DNA復(fù)制[1]與重組[2]、基因表達(dá)調(diào)控[3]、限制酶內(nèi)切[4]等過程中均涉及DNA或RNA與蛋白質(zhì)的相互作用。當(dāng)前,核酸與蛋白質(zhì)的相互作用研究是生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)及生物物理學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

自1991年核酸適配體[5]概念提出以來,以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的核酸適配體的篩選研究在生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。與蛋白質(zhì)結(jié)合的核酸適配體因其單鏈核酸的堿基序列多樣性及結(jié)構(gòu)多樣性,可通過形成發(fā)卡(hairpins)、莖環(huán)、G-四鏈體(G-quadruplex)等二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)靶標(biāo)的空間結(jié)構(gòu)匹配,形成高親和力和特異性結(jié)合。單鏈核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)通常發(fā)生在蛋白質(zhì)的局部區(qū)域,如15堿基和29堿基的人凝血酶核酸適配體是以G-四鏈體構(gòu)象分別與凝血酶帶有高密度正電荷的外部結(jié)合位點(diǎn)I和II結(jié)合。Maureen等[6]對(duì)1990至2013年間發(fā)表的492篇適配體篩選文獻(xiàn)中569種靶標(biāo)的2 334條適配體序列進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。將適配體篩選的靶分子分類為碳水化合物、細(xì)胞、核酸、肽、蛋白質(zhì)小分子與病毒,其中以蛋白質(zhì)作為靶分子進(jìn)行適配體篩選占所有篩選工作的58%。目前已報(bào)道的核酸適配體的蛋白質(zhì)靶標(biāo)包括生長(zhǎng)因子、酶、激素、毒素、細(xì)胞表面受體、微生物蛋白質(zhì)等。這些靶標(biāo)可通過分離純化獲得,也可使用同源蛋白質(zhì),或直接利用完整細(xì)胞。

與生物體內(nèi)的天然抗體相比,核酸適配體完全通過體外篩選獲得,無需動(dòng)物免疫。不僅可根據(jù)應(yīng)用條件篩選特定靶標(biāo)的適配體,還可通過篩選過程控制其與靶標(biāo)的親和力和特異性。核酸適配體的獲得是通過化學(xué)方法合成及修飾,實(shí)驗(yàn)成本低。此外,核酸適配體有較好的組織滲透性,易進(jìn)入細(xì)胞,且無免疫原性。近年來,蛋白質(zhì)的核酸適配體篩選在生物醫(yī)學(xué)研究、藥物研發(fā)、醫(yī)學(xué)成像、生物催化和生物檢測(cè)等領(lǐng)域已有大量的應(yīng)用報(bào)道[7-9]。例如,適配體作為靶蛋白質(zhì)的高效特異性抑制因子,用于蛋白質(zhì)與核酸互作的機(jī)制研究,確定蛋白質(zhì)與核酸結(jié)合位點(diǎn)與空間結(jié)構(gòu),精確調(diào)控靶蛋白質(zhì)的功能。Aarti等[10]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子IIB的RNA適配體能夠抑制其與TATA結(jié)合蛋白及與RNA聚合酶II的相互作用,使轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體無法形成,進(jìn)而阻斷轉(zhuǎn)錄進(jìn)程。2′-NH2修飾的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子特異性結(jié)合適配體后,可抑制血管生成,使黃斑變性所致的失明得到延緩,所開發(fā)的哌加他尼(Macugen)成為首例用于臨床治療的適配體藥物[11]。核酸適配體也可用于蛋白質(zhì)的分析檢測(cè)和純化。Berea等[12]報(bào)道了16位賴氨酸乙?；M蛋白H4的適配體篩選,該適配體解離常數(shù)(Kd)為21 nmol/L,親和力明顯高于與非乙酰化組蛋白(Kd=50 μmol/L)及8位乙?；M蛋白(Kd>50 μmol/L)的親和力,表明該適配體可特異性識(shí)別翻譯后修飾蛋白質(zhì)。通過體外篩選或別構(gòu)篩選方法獲得的適體酶(aptazymes)是具有催化活性的核酸適配體,可用于生物催化及酶固定化。Paola等[13]獲得的氯高鐵血紅素DNA適配體可在氯高鐵血紅素存在時(shí)表現(xiàn)出過氧化物酶活性,可開發(fā)為具有催化活性的G-四鏈體報(bào)告系統(tǒng),用于生物報(bào)告?zhèn)鞲衅鲗?duì)相應(yīng)底物的定量檢測(cè)。Qiao等[14]篩選的兩條β-葡萄糖醛酸酶的適配體可將β-葡萄糖醛酸酶從復(fù)雜的細(xì)胞溶解物中分離,調(diào)節(jié)pH值與離子強(qiáng)度,兩條適配體對(duì)β-葡萄糖醛酸酶純化率分別高達(dá)84%與88%。重復(fù)利用7次后,所純化的β-葡萄糖醛酸酶對(duì)甘草酸的轉(zhuǎn)化能力仍保持在70%以上。Song等[15]篩選的人重組蛋白上皮細(xì)胞黏附分子的適配體SYL3C對(duì)MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞株與Kato III胃癌細(xì)胞株的解離常數(shù)分別為(38±9) nmol/L與(67±8) nmol/L,該適配體經(jīng)異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記后分別與這兩種腫瘤細(xì)胞孵育后進(jìn)行共聚焦成像分析,結(jié)果顯示兩種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出高熒光信號(hào)。

盡管蛋白質(zhì)的核酸適配體有廣泛的應(yīng)用前景,但其適配體篩選也面臨著很多困難。其篩選過程復(fù)雜,人力、財(cái)力和時(shí)間耗費(fèi)大,篩選的適配體的親和力和特異性不理想,篩選的成功率不盡如人意。因此,目前有效可用的核酸適配體還非常有限,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際需要。近年來,針對(duì)核酸適配體篩選方法的研究主要涉及核酸庫(kù)優(yōu)化、篩選方法改進(jìn)、復(fù)合物分離、次級(jí)核酸庫(kù)的富集與單鏈拆分、適配體與靶分子親和力表征、適配體結(jié)構(gòu)優(yōu)化等方面,旨在改良和發(fā)展指數(shù)富集系統(tǒng)配體進(jìn)化(SELEX)技術(shù),提高篩選效率與適配體性能。本文歸納總結(jié)了2005年以來蛋白質(zhì)靶標(biāo)的適配體篩選的研究進(jìn)展,重點(diǎn)綜述了蛋白質(zhì)與核酸適配體復(fù)合物高效分離的多種方法(包括固定靶標(biāo)、固定核酸庫(kù)和非固定靶標(biāo)或核酸庫(kù)的方法),以及核酸庫(kù)的優(yōu)化方法、適配體的特征分析,及親和作用表征方法等。

1蛋白質(zhì)-核酸適配體復(fù)合物的分離方法

在篩選適配體的SELEX過程中,高效、快速地分離與靶標(biāo)結(jié)合的單鏈核酸是提高篩選效率的關(guān)鍵一步。其分離過程通常需要預(yù)先固定靶標(biāo)或單鏈核酸庫(kù),也有非固定的直接分離法。

1.1固定靶標(biāo)的分離方法

可將靶標(biāo)通過物理吸附、化學(xué)共價(jià)交聯(lián)以及生物素-親和素特異性相互作用等方式固定在微珠/磁珠、微孔板及親和層析柱等固相基質(zhì)上。與核酸庫(kù)孵育后,去除未結(jié)合核酸,再通過淋洗溶液洗脫固相基質(zhì)上的結(jié)合核酸,實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)核酸復(fù)合物與未結(jié)合或弱結(jié)合核酸的分離。

1.1.1微珠/磁珠SELEX法(bead-based SELEX)

微珠/磁珠是應(yīng)用最廣泛的固定靶標(biāo)的固相基質(zhì)。根據(jù)靶標(biāo)性質(zhì),可選擇不同的親和標(biāo)簽、親和樹脂以及耦合化學(xué)反應(yīng)使其固定在基質(zhì)上。通過孵育條件、洗脫條件優(yōu)化獲得與靶標(biāo)高親和力結(jié)合的核酸。該方法的局限性是固定相上靶標(biāo)的密度影響核酸結(jié)合。高密度固定的靶標(biāo)分子間存在的多重弱相互作用將產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),使靶標(biāo)之間產(chǎn)生結(jié)合作用,故會(huì)降低每輪篩選中適配體的富集效率,使后續(xù)的篩選不能達(dá)到滿意的效果[16]。Huang等[17]在篩選C反應(yīng)蛋白(CRP)的核酸適配體時(shí),將CRP與直徑為4.5 nm的聚苯乙烯磁珠共同孵育,使磁珠表面吸附CRP分子。這種方法操作簡(jiǎn)單,但可能會(huì)封閉靶標(biāo)的某些結(jié)合位點(diǎn)。鑒于此,又發(fā)展了通過化學(xué)反應(yīng)共價(jià)交聯(lián)固定靶標(biāo)的方法。Gong等[18]為了篩選能夠識(shí)別同一蛋白質(zhì)上不同結(jié)合位點(diǎn)的核酸適配體,同時(shí)采用了化學(xué)共價(jià)交聯(lián)和親和素-生物素特異性結(jié)合兩種固定方法。在親和結(jié)合部分,以整合蛋白αVβ3為靶標(biāo),在交聯(lián)劑EDC和NHS的作用下將其通過化學(xué)反應(yīng)共價(jià)交聯(lián)在羧基化的磁珠表面進(jìn)行篩選。在特異性結(jié)合部分,選取一種與αVβ3同樣有一個(gè)β3位點(diǎn)的αⅡbβ3蛋白作為“誘餌”蛋白質(zhì),通過生物素化處理,使其與鏈霉親和素修飾的磁珠通過親和作用固定在磁珠上。另一種模式是靶標(biāo)與隨機(jī)庫(kù)孵育后,通過親和樹脂捕獲靶標(biāo)核酸復(fù)合物,此法需要高容量的親和樹脂以保證捕獲效率。但該篩選模式也會(huì)因核酸與親和樹脂的非特異性結(jié)合使篩選效率降低[19]。

1.1.2微柱SELEX法(micro-column SELEX)

將靶標(biāo)直接固定在微柱內(nèi),或?qū)⒔宦?lián)了靶標(biāo)的瓊脂糖凝膠或親和層析樹脂填充在微柱中,制成含有靶標(biāo)的親和層析柱。該親和柱可吸附靶標(biāo)結(jié)合的核酸,與未結(jié)合或弱結(jié)合的核酸分離。微柱SELEX法可將親和樹脂及核酸庫(kù)用量最小化,使非特異性結(jié)合分離的死體積達(dá)到最小值[18]。目前的96通道微型柱裝置(micro-platebased enrichment device used for the selection of aptamers, MEDUS),可與96孔板匹配,進(jìn)行高通量的樣品處理[20]。常規(guī)固定法中高密度的靶標(biāo)擁擠會(huì)阻礙適配體與其作用,而微柱法則降低了靶標(biāo)在柱中的密度,更易獲得高親和力的適配體。應(yīng)用該方法篩選了解離常數(shù)為nmol/L級(jí)的熱休克因子1、2(HSF1、HSF2)[19],及轉(zhuǎn)錄延伸因子E(NELF-E)的適配體[21]。

1.1.3雙循環(huán)RNA適配體分離SELEX法(RAPID SELEX)

RAPID SELEX方法結(jié)合了Non-SELEX原理[22]和微柱固定靶標(biāo)方法。直接進(jìn)行連續(xù)兩輪的微柱分離,中間不進(jìn)行次級(jí)庫(kù)的逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增與轉(zhuǎn)錄。常規(guī)的SELEX,蛋白酶體磷酸酶UBLCP1與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶2(CHK2)兩種靶標(biāo)的RNA適配體篩選需進(jìn)行6輪,每次分離后都需進(jìn)行次級(jí)庫(kù)的擴(kuò)增。而運(yùn)用RAPID方法,6輪篩選過程中僅需進(jìn)行3次擴(kuò)增步驟,整體篩選周期從355 h降低到84 h。且兩種方法篩選出的5條性能最好的適配體,其序列具有一致性。

1.1.4微流控芯片SELEX法(SELEX-on-a-chip)

在芯片微流通道中填充磁珠介質(zhì),通過微流控芯片進(jìn)行靶標(biāo)-核酸復(fù)合物與未結(jié)合或弱結(jié)合核酸的分離。將磁珠法與微流控篩選(M-SELEX)結(jié)合,即微磁性分離法(MMS),可將磁力捕獲裝置微型化,使整個(gè)分離過程在微流通道中進(jìn)行。目前,已經(jīng)通過微磁性分離法,篩選獲得Kd為納摩爾級(jí)的A型肉毒菌神經(jīng)毒素與血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF-BB)核酸適配體[23-25],以及解離常數(shù)分別為0.028與0.33 nmol/L的高親和力的PDGF-BB與凝血酶適配體[26]。也有報(bào)道將C反應(yīng)蛋白(CRP)[17]與甲胎蛋白(AFP)[27]靶標(biāo)偶聯(lián)在磁珠上,利用微流控芯片的連續(xù)流體和磁性分離進(jìn)行適配體篩選。這種微型化組合集成了磁分離、微泵、微混合器以及酶促反應(yīng)擴(kuò)增溫度控制系統(tǒng),還成功用于復(fù)合靶標(biāo)流感病毒A/H1N1的適配體篩選[28]。通過有效處理磁珠及控制流體流動(dòng),可對(duì)肉毒神經(jīng)毒素A輕鏈[29]、鏈霉親和素[30]、PDGF-BB、凝血酶、與載脂蛋白E3[26]等多種靶標(biāo)進(jìn)行1～3輪的快速篩選,獲得解離常數(shù)為低納摩爾級(jí)的適配體。

也可將經(jīng)過特殊加工的具有納米孔結(jié)構(gòu)的溶膠-凝膠材料作為分離介質(zhì)。由于溶膠-凝膠能保持生物分子的活性并能提高生物分子的穩(wěn)定性,與磁珠和親和層析柱固定法相比,它也不需要任何修飾,因此這種包埋固定靶標(biāo)的方法更為簡(jiǎn)單。利用其固定靶標(biāo),結(jié)合芯片快速分離,可有效提高篩選效率,減少篩選輪數(shù)。Ahn等[31]利用納米孔溶膠-凝膠陣列芯片固定酵母TATA結(jié)合蛋白及其同源蛋白質(zhì),實(shí)現(xiàn)了多靶標(biāo)RNA核酸適配體的同時(shí)篩選。該芯片由5個(gè)六邊形小室和通道組成,分別在芯片的每個(gè)小室的溶膠-凝膠液滴內(nèi)固定不同的靶標(biāo),當(dāng)RNA隨機(jī)庫(kù)通入芯片時(shí),能與靶標(biāo)結(jié)合的RNA會(huì)進(jìn)入該溶膠-凝膠液滴內(nèi),而未與靶標(biāo)結(jié)合的RNA則流出通道,借此直接分離靶標(biāo)核酸復(fù)合物與未結(jié)合核酸。

1.1.5金納米顆粒法

金納米顆粒(AuNPs)具有優(yōu)良的電子和化學(xué)特性,其物理特性與其尺寸和形態(tài)相關(guān),且容易修飾上小分子或生物大分子,成為功能化金納米顆粒。目前它廣泛應(yīng)用于化學(xué)生物傳感、診斷成像及癌癥診斷與治療等領(lǐng)域[32]。AuNPs的生物功能化是通過巰基、磷酸基及氨基修飾來實(shí)現(xiàn),利用金-巰鍵是最常用的功能化方式。Takahashi等[33]為了篩選出能抑制β淀粉樣蛋白(Aβ)聚集的RNA核酸適配體,利用AuNPs與半胱氨酸形成的金巰鍵將靶標(biāo)Aβ固定在AuNPs的表面,篩選獲得N2-Flu(Kd=21.6 μmol/L)與E2-Flu(Kd=10.9 μmol/L)兩條適配體。

1.1.6膜固定法

將靶標(biāo)固定在膜(如硝酸纖維素膜)上,可分離核酸的結(jié)合鏈與未結(jié)合鏈。Tsukakoshi等[34]發(fā)展了一種基于硝酸纖維素膜固定靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)篩選核酸適配體的方法。先在同一塊硝酸纖維素膜的3個(gè)不同區(qū)域固定3種蛋白質(zhì),同時(shí)達(dá)到反篩的目的。將同時(shí)固定了核突觸蛋白(α-syn)的單體、低聚物及纖維3種形態(tài)的硝酸纖維素膜與隨機(jī)庫(kù)一起孵育。然后將固定了α-syn低聚物的硝酸纖維素膜部分裁剪下來,從膜上分離提取出與α-syn低聚物結(jié)合的DNA鏈。Liu等[35]選用聚偏氟乙烯膜(PVDF),通過電鍍印跡法在一張PVDF膜上固定人乙型肝炎病毒核心蛋白(HBcAg)作為正篩單元,而在另一塊PVDF膜上固定血清蛋白作為反篩單元。將隨機(jī)庫(kù)與兩塊PVDF膜同時(shí)孵育,多次沖洗并移除反篩的PVDF膜,可直接除去不與HBcAg結(jié)合的鏈;然后,再結(jié)合DNase I降解以及濃度梯度的尿素緩沖液沖洗,可有效除去與HBcAg不結(jié)合或結(jié)合較弱的鏈,使結(jié)合在正篩的PVDF膜上的DNA分子數(shù)從1016降到104。這樣只經(jīng)過一輪篩選就獲得Kd值為pmol/L級(jí)的核酸適配體。

1.1.7毛細(xì)管固定法

在堿性條件下,硼酸基團(tuán)能與鄰二羥基結(jié)構(gòu)作用,生成穩(wěn)定的五元環(huán)絡(luò)合物,酸性條件下絡(luò)合被打開,這一特性賦予了硼酸類親和色譜材料富集提取含有順二羥基結(jié)構(gòu)的各類生物分子的能力。將硼酸作為親和色譜配基固定在毛細(xì)管上,形成硼酸親和毛細(xì)管整體柱,可通過調(diào)節(jié)pH,控制可逆的共價(jià)結(jié)合,捕獲或釋放含有cis-diol官能團(tuán)的組分[36],實(shí)現(xiàn)分析、分離、鑒定核苷、核苷酸、糖、糖蛋白、酶以及小分子混合物的功能。Nie等[37]提出基于硼酸親和毛細(xì)管整體柱固定糖蛋白篩選核酸適配體的方法。以糖蛋白辣根過氧化物酶(HRP)作為模式蛋白質(zhì),調(diào)節(jié)pH>7,將HPR共價(jià)結(jié)合在硼酸親和毛細(xì)管內(nèi)壁上。隨機(jī)庫(kù)通過毛細(xì)管后,與HPR結(jié)合較強(qiáng)的DNA鏈被捕獲到毛細(xì)管內(nèi),此時(shí)再調(diào)節(jié)pH<3,使HRP-DNA復(fù)合物從毛細(xì)管中釋放,并在出樣口端收集,得到復(fù)合物。

1.2固定核酸庫(kù)的分離方法

因固定靶標(biāo)分子會(huì)改變其天然的分子構(gòu)象,故也發(fā)展了固定核酸庫(kù)的分離方法。固相基質(zhì)(如瓊脂糖凝膠、微珠或磁珠)表面修飾了鏈霉親和素,將修飾了生物素的單鏈DNA(ssDNA)序列作為捕獲探針,探針上的核酸序列可與核酸庫(kù)的局部序列互補(bǔ)。當(dāng)核酸庫(kù)通過堿基互補(bǔ)與捕獲探針雜交后,再通過生物素-鏈霉親和反應(yīng)固定在基質(zhì)上。在篩選過程中,用含靶標(biāo)的溶液洗脫固相基質(zhì),可將核酸庫(kù)中與靶標(biāo)結(jié)合強(qiáng)的ssDNA洗脫下來,故洗脫液中含有與靶標(biāo)結(jié)合的ssDNA,進(jìn)而得到靶蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物。

1.2.1親和層析柱固定核酸庫(kù)

親和層析柱固定核酸庫(kù)的方法被用于以核酸為靶分子的適配體篩選過程中,Raiendran等[38]以含有鏈霉親和素修飾的瓊脂糖凝膠作為填料,制成親和層析柱后用于固定核酸庫(kù),發(fā)展了一種通用的直接篩選核酸適配體分子信標(biāo)的方法。所用的捕獲探針上標(biāo)記了猝滅基團(tuán),當(dāng)熒光標(biāo)記的核酸庫(kù)通過捕獲探針固定在親和柱上,熒光發(fā)生猝滅。用核酸作為靶分子對(duì)固定的核酸庫(kù)進(jìn)行洗脫,使捕獲探針釋放出與靶分子結(jié)合的熒光標(biāo)記DNA,因此檢測(cè)到熒光強(qiáng)度明顯增加。他們通過9輪篩選得到了與靶分子相互作用的適配體,進(jìn)而也可將此種方法推廣到非核酸靶分子篩選中。

1.2.2微珠固定核酸庫(kù)法

將微珠進(jìn)行鏈霉親和素修飾,修飾后的微珠與帶有生物素化基團(tuán)的捕獲探針特異性結(jié)合,核酸庫(kù)通過與捕獲探針互補(bǔ)固定在微珠或磁珠上,與靶標(biāo)結(jié)合后就可通過離心或磁分離的方法快速分離未與靶標(biāo)結(jié)合的DNA鏈。Nutiu等[39]將巧妙設(shè)計(jì)的核酸庫(kù)固定在親和素包被的微珠上。與常規(guī)篩選所用的核酸庫(kù)不同,該核酸庫(kù)總長(zhǎng)為91 nt,其中,兩端分別是21 nt的引物序列,中間是一段19 nt的固定序列,在兩端的引物序列與中間的固定序列之間還分別設(shè)計(jì)了10 nt和20 nt的隨機(jī)序列區(qū)?？傞L(zhǎng)19 nt的固定序列包含4 nt的延長(zhǎng)序列和15 nt的與捕獲探針互補(bǔ)的序列。生物素化的捕獲探針能夠與微珠或磁珠上的親和素特異性結(jié)合。加入靶標(biāo)神經(jīng)生長(zhǎng)刺激肽(NTPs)與磁珠固定的核酸庫(kù)孵育,與NTPs結(jié)合較強(qiáng)的序列由雙鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)镹TPs-DNA復(fù)合物結(jié)構(gòu),從微珠上脫落;而結(jié)合較弱或不結(jié)合的DNA鏈則保留在微珠上,實(shí)現(xiàn)結(jié)合與未結(jié)合DNA鏈的分離。因在引物和互補(bǔ)短鏈上分別標(biāo)記了熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán),因此該篩選方法還可作為檢測(cè)方法,無需再對(duì)篩選的核酸適配體進(jìn)行后續(xù)的序列設(shè)計(jì)和優(yōu)化。Oh等[40]以凝血酶為靶標(biāo),將在兩段隨機(jī)序列間的固定序列設(shè)計(jì)成一段可形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)的序列。凝血酶存在時(shí),將隨機(jī)庫(kù)的DNA鏈從磁珠上競(jìng)爭(zhēng)下來,此時(shí)中間的固定序列會(huì)形成可以嵌入NMOL/LM染料的G-四鏈體結(jié)構(gòu),并在波長(zhǎng)614 nmol/L處產(chǎn)生極強(qiáng)的熒光,從而將凝血酶與DNA鏈的結(jié)合轉(zhuǎn)化為因結(jié)構(gòu)變化引起的熒光信號(hào)變化,形成自報(bào)告探針。

1.2.3微粒展示(particle display)

微粒展示法多用于同源蛋白質(zhì)的多重靶分子交替篩選。SELEX過程中需結(jié)合微乳液PCR技術(shù)及流式細(xì)胞儀進(jìn)行篩選[41]。首先需將固定于微球上的核酸庫(kù)(固定方法同1.2.2節(jié))與熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)靶標(biāo)共孵育,然后利用流式細(xì)胞儀分選與熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)結(jié)合的隨機(jī)序列微球。再通過微乳液PCR技術(shù)對(duì)每個(gè)微球的隨機(jī)序列擴(kuò)增(擴(kuò)增倍數(shù)為105)。利用此方法,3個(gè)循環(huán)篩選得到凝血酶[42]、載脂蛋白E (ApoE)、纖溶酶原激活劑抑制劑-1(PAI-1)[43]及腫瘤壞死因子受體4-1BB的高親和力適配體[44]。另外一種方法是通過微流體系統(tǒng)將隨機(jī)庫(kù)在瓊脂糖液滴中富集,再用流式細(xì)胞儀使寡核苷酸逐個(gè)與靶分子相互作用[45]。Zhang等[46]通過該方法篩選出Kd=25 nmol/L的絡(luò)氨酸蛋白磷酸化酶(Shp2 protein)的適配體。因該方法中需通過流式細(xì)胞儀逐個(gè)篩選與靶分子相互作用的ssDNA,再通過微乳液PCR逐個(gè)擴(kuò)增結(jié)合在靶蛋白質(zhì)上的ssDNA,所以核酸庫(kù)容量越大(序列越多)時(shí),對(duì)流式細(xì)胞儀與微流體系統(tǒng)的性能要求越高。所以這種篩選因受現(xiàn)有流式細(xì)胞儀分選能力的局限,很難實(shí)現(xiàn)大容量核酸庫(kù)中每個(gè)ssDNA的分選。微乳液PCR也很難實(shí)現(xiàn)單滴微乳中每個(gè)ssDNA的擴(kuò)增或流式細(xì)胞儀分選,進(jìn)而導(dǎo)致核酸庫(kù)不能被全部利用。目前方法還未用于RNA適配體的篩選。如果可在微乳液中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,則也可為RNA適配體篩選所用[47]。

1.3非固定靶標(biāo)或核酸庫(kù)的分離方法

無論固定靶標(biāo)或核酸庫(kù)都會(huì)影響分子的天然構(gòu)象。而且,固定基質(zhì)自身還會(huì)參與相互作用,產(chǎn)生非特異性吸附。因此,在篩選過程中不需要固定靶標(biāo)或者DNA/RNA核酸庫(kù)的非固定篩選方法更有優(yōu)勢(shì)。非固定方法通過靶標(biāo)與核酸庫(kù)在溶液中的自然結(jié)合,可在溶液相直接分離復(fù)合物。因靶標(biāo)與核酸庫(kù)的結(jié)合、分離過程完全在溶液中進(jìn)行,故可避免固定靶標(biāo)或核酸庫(kù)時(shí)發(fā)生的分子構(gòu)象變化,以及被固定分子、基質(zhì)與核酸結(jié)合時(shí)的空間位阻影響。

1.3.1超濾分離法

根據(jù)靶標(biāo)分子大小,選擇合適孔徑的硝酸纖維素膜。利用分子量差異,對(duì)靶標(biāo)的核酸復(fù)合物進(jìn)行超濾分離,通過4～18輪篩選獲得適配體。但因硝酸纖維素膜對(duì)蛋白質(zhì)和核酸均有一定的非特異性吸附,故篩選的適配體特異性較差。Gopinath等[48]對(duì)此法進(jìn)行改進(jìn),在每輪篩選前,使RNA隨機(jī)庫(kù)通過預(yù)先潤(rùn)濕的濾膜,以除去與濾膜非特異性結(jié)合的RNA鏈,篩選出能區(qū)別人甲型流感病毒亞型的RNA核酸適配體。這種分離方法使用了超濾膜及離心機(jī),設(shè)備簡(jiǎn)單,分離過程快。但靶蛋白質(zhì)與隨機(jī)庫(kù)耗費(fèi)量大,而且超濾分離過程容易破壞復(fù)合物,導(dǎo)致潛在適配體的丟失。

1.3.2凝膠電泳分離法

凝膠電泳是常用的蛋白質(zhì)和核酸分離方法。因形成的靶標(biāo)-核酸復(fù)合物與游離核酸的分子大小和荷電量相差較大,也可采用凝膠電泳分離。Smith等[49]利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離法篩選了人嗜中性粒細(xì)胞胰蛋白酶E的RNA核酸適配體。Tsukakoshi等[34]在競(jìng)爭(zhēng)篩選α-syn低聚物的核酸適配體時(shí),第一輪和第二輪篩選均采用3%的瓊脂糖凝膠電泳分離結(jié)合α-syn低聚物的DNA鏈,使結(jié)合α-syn低聚物的序列有一定程度的濃縮和富集。

1.3.3毛細(xì)管電泳-SELEX

毛細(xì)管電泳(CE)也是在自由溶液中分離靶標(biāo)-核酸復(fù)合物,它又是快速、高效篩選核酸適配體的方法之一。因靶標(biāo)和核酸庫(kù)分子完全在自由溶液中相互作用,故可保持二者的天然結(jié)構(gòu),也可以模擬生物分子相互作用的溶液環(huán)境。毛細(xì)管電泳過程中,未與靶標(biāo)結(jié)合的核酸分子與結(jié)合靶標(biāo)的核酸復(fù)合物的遷移速率有明顯差異,二者可完全分離,并可在毛細(xì)管出口端定時(shí)收集復(fù)合物。通常,CE-SELEX只需要1～4輪篩選就可獲得蛋白質(zhì)的適配體。有報(bào)道通過CE-SELEX方法篩選了蛋白質(zhì)靶標(biāo)Ig E[50]、神經(jīng)肽Y[51]、人類免疫缺陷病毒逆轉(zhuǎn)錄酶[52]、蓖麻毒素蛋白[53]、蛋白激酶C[54]以及炭疽桿菌保護(hù)性抗原[55]等適配體。CE-SELEX方法可進(jìn)一步改進(jìn)為平衡混合物的非平衡毛細(xì)管電泳(NECEEM)、平衡混合物的平衡毛細(xì)管電泳(ECEEM)及Non-SELEX等系列篩選方法[56-58]。Non-SELEX方法通過3輪NECEEM分離,但中間不需進(jìn)行次級(jí)庫(kù)的擴(kuò)增,就可將隨機(jī)庫(kù)與靶蛋白質(zhì)的親和力增加4個(gè)數(shù)量級(jí)。用Non-SELEX方法篩選的蛋白質(zhì)有人原癌基因蛋白、牛過氧化氫酶[59]、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白如Cdc42-GTP、PAK1、MRCK[57]等。需注意的是,靶標(biāo)-適配體復(fù)合物與游離核酸的電泳淌度差異還受電泳溶液性質(zhì)的影響。Non-SELEX方法對(duì)離子強(qiáng)度與pH要求嚴(yán)格,而這些條件可能會(huì)與SELEX其他步驟的溶液條件發(fā)生沖突。此外,由于CE分離的進(jìn)樣體積很小,單次進(jìn)樣的混合物樣品量很少,將導(dǎo)致可有效利用的隨機(jī)庫(kù)的序列數(shù)很少,因此分離的復(fù)合物不完全,存在核酸序列缺失的可能,故在每次篩選的重復(fù)性上可能會(huì)有差異,影響對(duì)篩選效果的判斷。分離復(fù)合物時(shí)因受到溶液鹽濃度和溫度的影響,可能還會(huì)因復(fù)合物與蛋白質(zhì)或者游離核酸遷移時(shí)間差異太小而難以互相分離。因此,適配體與靶分子的結(jié)合條件和復(fù)合物與核酸的分離條件可能難以統(tǒng)一,即最優(yōu)的結(jié)合條件與最優(yōu)的復(fù)合物分離條件不一致,導(dǎo)致最終的適配體結(jié)合條件較難界定。

1.3.4氧化石墨烯分離法

氧化石墨烯(graphene oxide, GO)是新型納米材料,具有良好的水溶性且表面易修飾。研究發(fā)現(xiàn)GO對(duì)ssDNA具有較強(qiáng)的吸附能力,而對(duì)雙鏈DNA(dsDNA)或結(jié)合了靶標(biāo)的核酸適配體的吸附能力則較弱。Park等[60]利用GO這一特點(diǎn)成功實(shí)現(xiàn)了Nampt蛋白的適配體篩選。將隨機(jī)核酸隨機(jī)庫(kù)與Nampt蛋白孵育后,加入適量的GO吸附未結(jié)合Nampt蛋白的游離ssDNA,通過離心可棄去GO-ssDNA沉淀。溶液中則保留了與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合的ssDNA,它們因構(gòu)象發(fā)生變化不能被GO吸附。經(jīng)過GO吸附和離心分離,得到Nampt蛋白-核酸復(fù)合物。他們通過4輪篩選,獲得G35、G40與G55共3條親和力較高的適配體。

1.3.5微流控自由流電泳(μFFE)

利用微流控芯片上的自由流電泳模式也可實(shí)現(xiàn)無固相介質(zhì)存在下的蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物分離。由于自由流電泳可連續(xù)進(jìn)樣,與CE-SELEX方法相比,μFFE能夠?qū)崿F(xiàn)300倍的初始庫(kù)容量(約1014個(gè)序列)連續(xù)進(jìn)樣,所有與核酸序列結(jié)合的復(fù)合物全部得到分離。僅一輪篩選就可獲得解離常數(shù)為nmol/L級(jí)的Ig E的DNA適配體。盡管μFFE的分辨率明顯低于CE-SELEX,但收集蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物時(shí),樣品被稀釋的程度也遠(yuǎn)低于CE-SELEX。通常利用μFFE分離時(shí),樣品被稀釋100倍。而利用CE-SELEX分離,則可能稀釋高達(dá)6 000倍。故μFFE分離獲得的復(fù)合物濃度明顯高于CE法,CE-SELEX過程中分離的復(fù)合物被高倍稀釋后,濃度很低[61]。

2核酸庫(kù)的設(shè)計(jì)優(yōu)化

隨機(jī)核酸庫(kù)通常由化學(xué)合成獲得,也可以通過基因組DNA設(shè)計(jì)以及體外轉(zhuǎn)錄等途徑獲得。篩選適配體時(shí)需設(shè)計(jì)合理的核酸庫(kù)。常規(guī)的隨機(jī)核酸庫(kù)設(shè)計(jì)為,序列兩端含引物序列,中間一般由20至60個(gè)堿基組成。如增加隨機(jī)序列的長(zhǎng)度,將使隨機(jī)庫(kù)中核酸分子的結(jié)構(gòu)多樣性呈指數(shù)級(jí)(4n,n為隨機(jī)序列中的堿基個(gè)數(shù))增長(zhǎng)。目前,核酸庫(kù)的設(shè)計(jì)優(yōu)化策略主要包括以下4種:(1)對(duì)核酸庫(kù)序列中核糖或堿基部分進(jìn)行修飾,增加隨機(jī)序列二級(jí)結(jié)構(gòu)多樣性、ssDNA的穩(wěn)定性以及對(duì)靶分子的識(shí)別能力;(2)減少引物序列,避免引物序列對(duì)適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的干擾,減少引物區(qū)域與靶分子的非特異性結(jié)合;(3)通過高通量測(cè)序分析次級(jí)庫(kù)的序列特征,改變核酸庫(kù)的合成方案,以增加與靶分子結(jié)合的序列或基序;(4)選擇鏡像核酸庫(kù)等替代核酸庫(kù),避免核酸酶對(duì)其降解。

2.1核酸分子中的基團(tuán)替換設(shè)計(jì)

應(yīng)用最多的核酸庫(kù)修飾是對(duì)核糖和堿基進(jìn)行基團(tuán)替換。如核糖2′位進(jìn)行氟代(2′-fluoro)、氨基化(2′-amino)或者甲基化(2′-omethyl)等修飾。Bompiani等[62]在2′位氟化的胞嘧啶與尿嘧啶隨機(jī)庫(kù)中,通過纖維素膜過濾-SELEX方法篩選獲得凝血素即凝血酶前體的高親和性RNA適配體(R9D-14),通過表面等離子體共振(SPR)方法測(cè)定Kd=1.4 nmol/L。Sakai等[63]對(duì)人受磷蛋白(PLN,跨膜蛋白)篩選RNA適配體時(shí),將RNA適配體5′端引物序列中的腺苷在氨基位進(jìn)行硫代磷酸化修飾,通過Ni3+-NTA微球固定靶分子,經(jīng)13輪篩選獲得Kd=11 nmol/L的適配體。

低解離率修飾適配體(slow off-rate modified aptamers, SOMAmers)來自于一種特殊核酸庫(kù)。將核酸中的胸腺嘧啶或尿嘧啶堿基的5′位用芐基、萘基、色胺基或異丁基等基團(tuán)取代,以增加隨機(jī)庫(kù)的化學(xué)多樣性和對(duì)靶分子的結(jié)合能力。目前,已經(jīng)有上千種蛋白質(zhì)的SOMAmers被篩選出來用于高通量蛋白質(zhì)組分析[64]。

鎖核酸(locked nucleic acids, LNAs)含有特殊的核糖-磷酸骨架。因β-D-呋喃核糖的2′-O、4′-C位通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋而連接成環(huán)形。這個(gè)環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3′-內(nèi)型的N構(gòu)型,降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性,卻增加了磷酸骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。由于LNA與DNA/RNA在結(jié)構(gòu)上具有相同的磷酸骨架,故其對(duì)DNA、RNA有很好的識(shí)別能力和親和力,能夠在適配體中形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。且LNA-RNA或LNA-DNA雜交雙鏈結(jié)構(gòu)具有更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性以及抑制3′脫氧核苷酸酶的降解作用[65]。F?ster等[66]將蓖麻毒素A鏈適配體(RA80.1. d1)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的莖干區(qū)域用連續(xù)的LNA代替,形成7個(gè)堿基對(duì)的雙鏈區(qū)域,發(fā)現(xiàn)此種LNA修飾的適配體比原適配體對(duì)靶分子結(jié)合能力更強(qiáng),同時(shí)表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性,且可防止核糖核酸酶的降解作用。Ida等[67]以重組的組氨酸標(biāo)記的CD73為靶分子進(jìn)行6輪篩選。篩選應(yīng)用了限定的預(yù)頸環(huán)結(jié)構(gòu)庫(kù)(pre-defined stem-loop library)。該隨機(jī)庫(kù)在引物區(qū)域前段包含了LNA。在第一、三、六輪篩選后擴(kuò)增,通過新一代測(cè)序技術(shù)得到篩選序列的信息,用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列統(tǒng)一,聚類分析,豐富序列對(duì)比后獲得3個(gè)適配體。其中兩個(gè)具有序列相似性,通過SPR法測(cè)得Kd值分別為10 nmol/L與3.5 nmol/L。如將LNA部位去除,則適配體與靶分子的親和力降低。說明增加引物區(qū)域的LNA設(shè)計(jì)對(duì)適配體穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成有促進(jìn)作用,也說明引物區(qū)域參與了適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。

2.2引物序列的堿基數(shù)設(shè)計(jì)

目前用于篩選的常規(guī)核酸庫(kù)的核酸序列全長(zhǎng)為60～100 nt,引物序列為30～32 nt,引物序列約占核酸序列長(zhǎng)度的一半。這些引物序列中的堿基可能與隨機(jī)序列區(qū)域或另一端的引物序列中的堿基配對(duì),破壞了序列的天然二級(jí)結(jié)構(gòu),也降低了隨機(jī)庫(kù)序列的結(jié)構(gòu)多樣性,即降低了核酸庫(kù)的容量。核酸庫(kù)容量的降低則可能導(dǎo)致篩選效率的降低。同時(shí),較長(zhǎng)的引物序列也可能與靶標(biāo)產(chǎn)生較強(qiáng)的非特異性結(jié)合。而且,較長(zhǎng)的引物序列也明顯增加核酸庫(kù)的合成成本,造成浪費(fèi)。因此,可通過縮短引物序列或取消引物序列對(duì)核酸庫(kù)進(jìn)行優(yōu)化。在雙RNA庫(kù)篩選方法中,設(shè)計(jì)的核酸庫(kù)的引物序列可自身折疊互補(bǔ),在引物區(qū)形成雙鏈結(jié)構(gòu),從而使引物序列與靶分子的非特異性結(jié)合可能性大大降低。但是,為完成引物序列雙鏈結(jié)構(gòu)的剪切,雙RNA庫(kù)仍需保留7～10個(gè)核堿基的保守序列[68]。而Pan等[69]報(bào)道了無需引物的SELEX方法(primer-free SELEX)。將無引物的單鏈核酸庫(kù)用于S100B靶蛋白質(zhì)的適配體篩選,獲得的適配體解離常數(shù)介于10-7～10-8mol/L之間。該方法對(duì)雙RNA庫(kù)進(jìn)一步優(yōu)化,在引物序列與自身的互補(bǔ)序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)之后,用內(nèi)切酶切除雙鏈DNA。使用不同的內(nèi)切酶可以使隨機(jī)庫(kù)在3′末端保留兩個(gè)C殘基,或者不保留核苷酸殘基,而在完成一輪篩選之后通過自身橋接寡核苷酸的雜交將次級(jí)庫(kù)再次連接上引物,用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增。盡管該方法所涉及的酶反應(yīng)更加復(fù)雜,但是為無需引物的SELEX步驟的設(shè)計(jì)提供了新的途徑。該方法已被用于人類免疫缺陷病毒(HIV)逆轉(zhuǎn)錄酶適配體的篩選[70]。

2.3基于高通量測(cè)序分析的序列設(shè)計(jì)

通過對(duì)逐輪篩選的次級(jí)庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序,可獲得每輪次級(jí)庫(kù)的序列信息。通過生物信息學(xué)分析可分析出次級(jí)庫(kù)中的重復(fù)序列,重復(fù)序列成為適配體序列的可能性更大。利用測(cè)序分析獲得的隨機(jī)序列區(qū)域的核苷酸堿基分布規(guī)律信息,可以指導(dǎo)核酸庫(kù)的設(shè)計(jì)合成,優(yōu)化隨機(jī)核酸庫(kù)序列的組成,增加能與靶分子結(jié)合的序列或基序的分布。

此外,初始核酸庫(kù)應(yīng)該提供篩選的最佳的起始點(diǎn)。目前常用的初始核酸庫(kù)的4種堿基處于隨機(jī)的均衡分布狀態(tài)。適配體序列中短的基序通常能與靶分子結(jié)合,而平均分配的基序增加了序列空間多樣性,增加了產(chǎn)生具有結(jié)合能力適配體出現(xiàn)的幾率。合成的核酸庫(kù)在實(shí)際庫(kù)容量與結(jié)構(gòu)多樣性方面不能達(dá)到篩選的需求,高通量測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)分析能夠緊密地監(jiān)控與優(yōu)化庫(kù)的合成。Rachel等[71]運(yùn)用CE-SELEX方法結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù),以卵巢癌生物標(biāo)記物HE4為靶分子通過5輪篩選獲得解離常數(shù)為390 nmol/L的適配體。分別對(duì)每輪篩選所獲得的次級(jí)庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序,通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列的比值從11.8%增至37.7%,驗(yàn)證了SELEX過程中每輪的篩選效率有所增加。

2.4其他核酸庫(kù)

核酸酶可導(dǎo)致核酸適配體序列被降解,修飾核酸適配體可增加其穩(wěn)定性,但不能完全消除其降解現(xiàn)象。而選擇鏡像適配體(spiegelmers)庫(kù)則可避免核酸酶的降解。鏡像適配體序列是天然核酸的對(duì)映體,由L-核糖核酸或L-2′脫氧核糖核酸構(gòu)成,spiegelmers具備了適配體的特性但對(duì)核酸酶不敏感。利用spiegelmers庫(kù)篩選適配體時(shí),也需要靶蛋白質(zhì)的對(duì)映異構(gòu)體。由于合成蛋白質(zhì)的D-對(duì)映體難以實(shí)現(xiàn),因此,利用spiegelmers核酸庫(kù)篩選的主要是細(xì)胞因子與肽類激素等小分子的適配體。如促性腺激素釋放激素[72]以及胃饑餓素[73]已經(jīng)篩選出spiegelmers。無論適配體還是spiegelmers,都是通過對(duì)靶分子中特定結(jié)構(gòu)域的識(shí)別產(chǎn)生相互作用。故可將蛋白質(zhì)分子的抗原表位作為靶位點(diǎn),篩選spiegelmers。Purschke等[74]以葡萄球菌腸毒素B(28 kDa)抗原表位的25個(gè)D-氨基酸組成的多肽作為作用區(qū)域,篩選出的spiegelmers與D-氨基酸構(gòu)成的多肽的解離常數(shù)為Kd=200 nmol/L,而與完整蛋白質(zhì)的解離常數(shù)為Kd=420 nmol/L; Szeitner等[75]以肌鈣蛋白I的N端擴(kuò)展區(qū)中的多肽分子(含9個(gè)氨基酸)的對(duì)映體為靶分子,篩選獲得解離Kd=3.5 nmol/L與Kd=10.7 nmol/L的spiegelmers。

此外,其他類型的核酸庫(kù)也可用于性質(zhì)不同的靶分子的適配體篩選。Feng等[76]針對(duì)乙肝病毒聚合酶篩選適配體。靶標(biāo)為刪節(jié)后的重組蛋白mini P,通過Ni2+NTA瓊脂糖微球固定重組蛋白mini P方法,經(jīng)3輪篩獲得到S6與S9兩條適配體。他們所用的隨機(jī)庫(kù)為兩種上頸環(huán)隨機(jī)序列RNA庫(kù)(upper stem-randomized RNA pools),其隨機(jī)序列位于RNA上部莖環(huán)結(jié)構(gòu)處。

3適配體的序列特征分析

3.1序列分析

適配體篩選中將分離得到大量不同的蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物。說明可與蛋白質(zhì)結(jié)合的核酸通常是具有不同堿基序列的一組核酸,該核酸組的序列都對(duì)靶蛋白質(zhì)具有一定的親和力。而多輪篩選后可獲得的核酸序列數(shù)大大減少,但這些序列對(duì)靶標(biāo)則具有更高的親和力和特異性識(shí)別。經(jīng)過多輪篩選后獲得的核酸序列需要進(jìn)行特征分析,以及親和力和特異性分析,以確定優(yōu)選的適配體序列及二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)適配體的特征分析通常包括:

(1)適配體序列的同源性分析。利用DNAman等分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)分析,得到各序列的拷貝數(shù),根據(jù)序列的拷貝數(shù)選擇核酸適配體候選序列。重復(fù)數(shù)越多的序列,極有可能是與靶標(biāo)結(jié)合較強(qiáng)的序列,說明它們經(jīng)過多輪反復(fù)篩選后仍然得以保留。

(2)適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。目前,有多種軟件可用于適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)分析,如MFOLD(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)、Quikfold Web server(http://unafold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Quickfold)以及RNA Structure v3.5/4.6/5.2(http://www.bio-soft.net/rna/RNAstructure.htm)等可進(jìn)行核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的預(yù)測(cè)。

(3)確定可與蛋白質(zhì)靶標(biāo)作用的最短序列的適配體。通過適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)分析,可合成各種保持了結(jié)合功能的更短序列,并檢測(cè)其與蛋白質(zhì)靶標(biāo)的結(jié)合能力。選擇親和力和特異性最優(yōu)的最短核酸序列,以節(jié)約合成成本。

3.2適配體的特征結(jié)構(gòu)

核酸適配體通常以一定的空間構(gòu)象及二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)作用。一般認(rèn)為在核酸序列中沒有形成堿基互補(bǔ)配對(duì)的位點(diǎn)是與靶分子特異性相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn),而適配體中形成的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域則是與蛋白質(zhì)靶標(biāo)的空間結(jié)構(gòu)相互作用的識(shí)別性元件[77,78]。一些篩選的適配體自身呈現(xiàn)出無二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由形態(tài),但與蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合后則能夠形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)[77,79,80]。蛋白質(zhì)靶標(biāo)的單個(gè)適配體中,一般僅有一種或兩種結(jié)構(gòu)區(qū)域,出現(xiàn)頻率最高的為發(fā)夾結(jié)構(gòu)、假結(jié)(pseudoknots)以及G-四鏈體。其中,發(fā)夾結(jié)構(gòu)是最普遍的適配體識(shí)別的結(jié)構(gòu)元件。而假結(jié)通過發(fā)夾環(huán)序列左右兩側(cè)的配對(duì)作用產(chǎn)生,是RNA適配體的典型特征,在DNA適配體中也有發(fā)現(xiàn)[78,80,81]。G-四鏈體比前述兩種單一的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性,是典型的DNA適配體結(jié)構(gòu),在RNA適配體中也有發(fā)現(xiàn)[82-90]。G-四鏈體中不同核苷酸形成的環(huán)結(jié)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)靶分子識(shí)別的基礎(chǔ)。

3.3親和力與特異性分析

由于蛋白質(zhì)靶能為適配體提供更大的相互作用區(qū)域,其與適配體結(jié)合的親和力明顯高于與小分子的作用,蛋白質(zhì)結(jié)合適配體的解離常數(shù)為10-11～10-9mol/L,高出小分子的解離常數(shù)(通常為10-5～10-7mol/L[91])2～4個(gè)數(shù)量級(jí)。

具有一定親和力的適配體與蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合時(shí)還需考慮結(jié)合的特異性。適配體與靶蛋白質(zhì)的作用強(qiáng)弱取決于二者的結(jié)合位點(diǎn)。因不同蛋白質(zhì)具有的空間結(jié)構(gòu)的可變區(qū)不同,若適配體結(jié)合在蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)可變區(qū)域,其特異性將比其結(jié)合在保守區(qū)域更強(qiáng)。適配體的特異性還與其親和力相關(guān),親和力越高的適配體,其與蛋白質(zhì)靶標(biāo)的結(jié)合能力越強(qiáng),蛋白質(zhì)分子表面的空間構(gòu)象的改變都可能影響適配體的特異性,使特異性降低。此外,蛋白質(zhì)的同源程度也對(duì)適配體特異性也有一定影響,這種影響還因蛋白質(zhì)而異。如HIV-1病毒的馬達(dá)蛋白的適配體能夠識(shí)別HIV-2病毒的馬達(dá)蛋白,親和力是HIV-1病毒的馬達(dá)蛋白的65%[92]。而蛋白激酶C的適配體與其同源蛋白質(zhì)的親和力僅為蛋白激酶C的4%[93]。經(jīng)過定點(diǎn)突變的凝血酶[94]、HIV-1病毒逆轉(zhuǎn)錄酶[64]、丙型肝炎病毒復(fù)制酶[23],這些突變蛋白質(zhì)與適配體的復(fù)合物的解離常數(shù)較未突變蛋白相比,均提高了1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。

不同靶蛋白質(zhì)的同源蛋白質(zhì)與其適配體的親和力有較大差異。據(jù)此可推測(cè)這些適配體可能通過與蛋白質(zhì)靶上的某些單個(gè)氨基酸的相互作用進(jìn)行蛋白質(zhì)的識(shí)別。而這個(gè)與適配體相互作用的氨基酸可能存在于蛋白質(zhì)的同源區(qū)域也可能存在于蛋白質(zhì)的非同源區(qū)域。而且,適配體對(duì)靶蛋白質(zhì)的同源蛋白質(zhì)的親和性還與適配體的篩選方法有關(guān)。因此,在適配體篩選過程中,可根據(jù)特異性需要對(duì)篩選步驟進(jìn)行優(yōu)化。不同蛋白質(zhì)適配體篩選的需求和目的不同。有時(shí),并非一個(gè)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)一個(gè)適配體。行使相同功能的蛋白質(zhì)家族(僅有一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸的差異,這種差異可能與蛋白質(zhì)功能無關(guān)),如要篩選的適配體是能夠作用于其功能結(jié)構(gòu)域的,即同一家族蛋白質(zhì)的功能一樣,功能結(jié)構(gòu)域也相同,則所篩選的適配體不需要對(duì)這一家族蛋白質(zhì)逐個(gè)進(jìn)行區(qū)分。然而,如果僅需要篩選其中某種蛋白質(zhì)的適配體,目的是將這種蛋白質(zhì)與其同源蛋白質(zhì)區(qū)分開,則需要通過反篩等手段篩選出該蛋白質(zhì)的高特異性的適配體。因此,如果需要區(qū)別靶蛋白質(zhì)與其相關(guān)蛋白質(zhì),則需選擇對(duì)某種蛋白質(zhì)具有高特異性結(jié)合的適配體。反之,如果需要對(duì)幾種相關(guān)蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行適配體篩選,如篩選不同物種中的直系同源蛋白質(zhì)的適配體,則可同時(shí)將幾種蛋白質(zhì)作為靶標(biāo)進(jìn)行SELEX[95]。

4親和力表征方法

從隨機(jī)核酸庫(kù)中篩選與靶蛋白質(zhì)具有高親和性和特異性的核酸序列是適配體篩選的最終目的。多輪篩選過程中,靶標(biāo)與不同次級(jí)庫(kù)的親和力應(yīng)逐漸增加,明顯強(qiáng)于與初始核酸庫(kù)的作用。多輪篩選過程中,對(duì)強(qiáng)結(jié)合核酸序列的篩選可通過靶標(biāo)-次級(jí)庫(kù)復(fù)合物的解離常數(shù)的測(cè)定進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。篩選輪次越多,解離常數(shù)越低。靶標(biāo)與核酸序列以及次級(jí)庫(kù)親和力的表征通常需通過“靶標(biāo)”、“靶標(biāo)-核酸復(fù)合物”與“未結(jié)合核酸”的完全分離,依據(jù)其平衡濃度求算解離常數(shù)。測(cè)定方法有透析法、超濾法、凝膠電泳法、毛細(xì)管電泳法、液相色譜法等。也可不需分離,直接測(cè)定含有“靶標(biāo)”、“靶標(biāo)-核酸復(fù)合物”與“未結(jié)合核酸”的混合溶液。這類方法有熒光各向異性/偏振、紫外光譜法、表面等離子共振和等溫滴定熱量測(cè)定法等。因測(cè)定方法和條件不同,測(cè)得的解離常數(shù)也會(huì)存在差異。但解離常數(shù)可用于親和力強(qiáng)弱的定性比較。

表1列舉了常用的解離常數(shù)測(cè)定方法和實(shí)驗(yàn)條件。

表 1　　　親和力表征方法及條件

表 1　　　(續(xù))

LIF: laser induced fluorescence detection; ELIASA: enzyme-linked immunosorbent assay; SPR: surface plasmon resonance; ITC: isothermal titration calorimeter.

5總結(jié)與展望

近年來,針對(duì)適配體高效篩選方法的研究報(bào)道主要涉及核酸庫(kù)的優(yōu)化、復(fù)合物分離、次級(jí)核酸庫(kù)的富集與單鏈拆分、適配體與靶分子親和力表征、適配體結(jié)構(gòu)優(yōu)化等方面。當(dāng)前,隨著高通量測(cè)序和計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)等多種新技術(shù)的快速發(fā)展,隨機(jī)庫(kù)序列的生物信息學(xué)分析為適配體的高效篩選提供了新的思路和方法。但自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化的適配體篩選程序和方法尚未出現(xiàn),適配體篩依然面臨著很多困難,至今有效可用的適配體還十分有限,遠(yuǎn)遠(yuǎn)還不能滿足實(shí)際需求。

由于蛋白質(zhì)種類繁多、分子量大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜、性質(zhì)差異大,其與核酸序列和隨機(jī)庫(kù)相互作用的機(jī)理也不盡相同。目前,還少有從靶分子性質(zhì)與相互作用機(jī)理的角度進(jìn)行篩選研究的報(bào)道。適配體篩選應(yīng)考慮的核心問題是提高親和力與特異性,而蛋白質(zhì)靶的帶電性、構(gòu)象、組成序列等性質(zhì)對(duì)其與ssDNA親和力的影響不容忽視。本課題組正在進(jìn)行針對(duì)蛋白質(zhì)靶的篩選策略研究,針對(duì)不同蛋白質(zhì)有必要設(shè)計(jì)不同的篩選策略。從蛋白質(zhì)靶的性質(zhì)出發(fā),探討蛋白質(zhì)靶的適配體篩選的本質(zhì)將有助于提高蛋白質(zhì)靶的適配體篩選效率。

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Research advances of aptamers selection for protein targets

YANG Ge1, WEI Qiang1, ZHAO Xinying2, QU Feng1*

(1. School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China;2. Beijing Center for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089, China)

Abstract:Aptamers are selected through systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX), and are artificially synthesized single-stranded DNA or RNA with high affinity and specificity against a wide variety of target molecules. Since some functional proteins play the key role in life process, aptamers against proteins have attracted great attention in the last decade, and are used in basic research and wide applications. The performance of aptamers depends on their affinity, specificity and stability. In recent years, many SELEX methods have been developed to enhance the properties of aptamers, improve selection efficiency and reduce cost. The main procedure of SELEX includes the isolation of target-aptamer compound, optimization the random ssDNA library, enrichment of ssDNA and the analysis and characterization of selected aptamers. In this review, we summarize the developments of aptamer selection methods for protein targets since 2005, discuss their shortcomings and limitations, and introduce the optimization of ssDNA library, aptamer sequence character and analytical methods for their affinity analysis.

Key words:aptamer; protein; selection; systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX); review

中圖分類號(hào):O658

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000-8713(2016)04-0370-12

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(21175011,21375008);國(guó)家“973”項(xiàng)目(2012CB910603).

*收稿日期:2015-12-14

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.12014

多尺度靶標(biāo)的核酸適配體篩選研究進(jìn)展專欄

·專論與綜述

*通訊聯(lián)系人.E-mail:qufengqu@bit.edu.cn.

Foundation item: National Nature Science Foundation of China (Nos.21175011, 21375008); National “973” Project(2012CB910603).