陳承曉,張琪惠,李春梅,田淋,莫發(fā)榮(北海市人民醫(yī)院，廣西北海536000；廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

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·論著·

人肝癌相關(guān)抗原Cdc25C特異性多肽抗體的制備及其應(yīng)用

陳承曉1,張琪惠2,李春梅2,田淋2,莫發(fā)榮2(1北海市人民醫(yī)院，廣西北海536000；2廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

摘要：目的制備抗人肝癌相關(guān)抗原Cdc25C特異性多肽抗體，為進(jìn)一步研究Cdc25C的功能奠定基礎(chǔ)。方法 通過生物信息學(xué)軟件對(duì)人Cdc25C蛋白的抗原屬性進(jìn)行分析，綜合考慮多肽的純度、氨基酸組成、長(zhǎng)度、親水性和二級(jí)結(jié)構(gòu)等，得到若干個(gè)同源性低、抗原性較高的候選多肽。多肽合成后與KLH佐劑偶聯(lián)，免疫新西蘭大白兔，制備相應(yīng)的多克隆抗體。經(jīng)ELISA和Western blotting方法鑒定其活性，并以免疫組化法檢測(cè)多肽抗體的效果。結(jié)果多肽抗體的效價(jià)較高, 特異性強(qiáng)。以多肽抗體對(duì)重組表達(dá)的Cdc25C融合蛋白進(jìn)行Western blotting鑒定，于73 kD附近有明顯反應(yīng)條帶。以全蛋白的單克隆抗體和多肽抗體檢測(cè)同一肝細(xì)胞癌癌旁組織，購買的Cdc25C單克隆抗體與制備的Cdc25C多肽多克隆抗體平均光密度分別為0.538±0.192、0.410±0.122，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.109,P>0.05)。結(jié)論 成功制備抗人肝癌相關(guān)抗原Cdc25C特異性多肽抗體；篩選獲得的候選多肽具有Cdc25C全蛋白一樣的抗原性，制備的多肽抗體具有和針對(duì)Cdc25C全蛋白抗體一樣的效果。

關(guān)鍵詞：肝腫瘤；肝癌相關(guān)抗原；Cdc25C多肽；多克隆抗體

細(xì)胞周期蛋白Cdc25C在真核生物細(xì)胞有絲分裂中起重要調(diào)節(jié)作用，其與G2/M期檢測(cè)點(diǎn)關(guān)鍵調(diào)控分子Cdc2/cyclin B的結(jié)合，決定細(xì)胞是否進(jìn)入有絲分裂周期[1]。Cdc25C還是一個(gè)新的腫瘤相關(guān)抗原[2]。初步RT-PCR結(jié)果顯示，Cdc25C在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)(16/30)[3]。為深入研究Cdc25C的功能區(qū)域及其在腫瘤發(fā)病、診斷和臨床免疫治療中的作用，我們于2014年采用生物信息學(xué)方法篩選出同源性低、抗原性較高的Cdc25C多肽片段，采用固相多肽合成法合成多肽，用于免疫新西蘭大白兔，制備相應(yīng)的多克隆抗體。

1材料與方法

1.1材料肝細(xì)胞癌(HCC)癌旁組織來源于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院；完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)購自Gibco BRL公司；Anti-Cdc25C antibody[E302]單克隆抗體購自英國(guó)Abcam公司；即用型免疫組化試劑盒和DAB試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔二抗購自Rockland公司，新西蘭大白兔(2.5 kg)、TMB試劑、ELISA試劑盒和Western blotting等試劑盒由南京金斯瑞公司提供。

1.2Cdc25C特異性多肽的設(shè)計(jì)和篩選為設(shè)計(jì)出能引起預(yù)期免疫效應(yīng)的抗原多肽，通過Optimum AntigenTM設(shè)計(jì)工具，對(duì)Cdc25C蛋白的屬性進(jìn)行分析，以JW算法對(duì)抗原進(jìn)行預(yù)測(cè)，保證抗原設(shè)計(jì)的合理性，綜合考慮多肽的純度、氨基酸組成、長(zhǎng)度、親水性和β-轉(zhuǎn)角、β-折疊、α-螺旋等二級(jí)結(jié)構(gòu)，得到若干個(gè)候選多肽片段。將之與特異性蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，篩選出最能引起預(yù)期免疫效應(yīng)，并能將同源效應(yīng)和產(chǎn)生非特異性反應(yīng)降低到最小的三個(gè)候選多肽,起始位點(diǎn)分別為64、185、407，抗原決定簇序列分別為ADLDETGHLDSSGLC、CYRSPSMPENLNRPR、PMHHQDHKTELLRC。

1.3多肽抗原合成采用9-氟甲氧羰固相合成法合成多肽片段。多肽經(jīng)過純化后，利用高效液相色譜法測(cè)定純度，三個(gè)候選多肽純度分別達(dá)到85.4%、89.6%、94.1%。為保證合成多肽的序列正確，我們對(duì)其進(jìn)行了MS/MS質(zhì)譜測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示三個(gè)多肽分子序列均正確無誤。

1.4Cdc25C特異性多肽多克隆抗體的制備經(jīng)馬來酰亞胺基苯甲酸琥珀酰亞胺酯活化的鑰孔戚血藍(lán)素按1∶1的比例與純化后的多肽孵育3 h進(jìn)行偶聯(lián)，之后轉(zhuǎn)移到透析袋中，PBS浸泡除鹽，4 ℃過夜后，得到多肽-血藍(lán)蛋白化合物(免疫原)。取多肽-血藍(lán)蛋白化合物200 μg溶于250 μL的PBS(0.1 mol/L pH 7.4 )，與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后, 對(duì)新西蘭大白兔皮下多點(diǎn)注射。以后以不完全弗氏佐劑取代完全弗氏佐劑，每2周免疫1次，共接種6次。每次免疫后的第 10～14天，從兔耳靜脈采血測(cè)定抗體效價(jià)，直至獲得滿意的抗體效價(jià)，制備出相應(yīng)的兔抗血清。

1.5Cac25C特異性多克隆抗體效價(jià)測(cè)定采用ELISA法檢測(cè)Cdc25C特異性多肽多克隆抗體的效價(jià)，根據(jù)信噪比S/N>2.1(S/N=2為最小檢出限)確定三個(gè)多肽抗體滴度。

1.6Cdc25C特異性多肽多克隆抗體的應(yīng)用以購買英國(guó)Abcam公司的Anti-Cdc25C antibody[E302]單克隆抗體和制備的特異性多肽多克隆抗體對(duì)重組表達(dá)的TRx-His-Cdc25C融合蛋白進(jìn)行Western blotting鑒定。采用免疫組化法，以購買的單克隆抗體與制備的多肽抗體檢測(cè)同樣的HCC癌旁組織，切片經(jīng)病理圖像分析系統(tǒng)拍照后用圖像分析軟件Image-pro plus 6.0獲得陽性反應(yīng)顆粒的平均光密度值(光密度值越高說明陽性反應(yīng)越強(qiáng)，可進(jìn)行定量分析)。

2結(jié)果

2.1多克隆抗體的效價(jià)三個(gè)候選多肽制備的多克隆抗體滴度分別達(dá)到1∶16 000、1∶16 000和1∶32 000。

2.2Cdc25C特異性多肽多克隆抗體的應(yīng)用效果以購買的單克隆抗體(圖1-A)和制備的特異性多肽多克隆抗體(圖1-B)進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果均在73 kD附近有明顯反應(yīng)條帶(TRx-His相對(duì)分子質(zhì)量約20 kD，Cdc25C相對(duì)分子質(zhì)量約53 kD)。上述兩種抗體在免疫組化染色中的平均光密度分別為0.538±0.192、0.410±0.122，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.109,P>0.05)。制備的多肽多克隆抗體具有和針對(duì)Cdc25C全蛋白的單克隆抗體等同的效果，篩選出來的多肽能代表Cdc25C全蛋白的抗原性。

注：M為ProteinRulerTM ⅡMarker；1、2為原核表達(dá)的Cdc25C融合蛋白。

圖1 Western blotting法檢測(cè)Cdc25C抗體效果

3討論

細(xì)胞周期蛋白Cdc25C或其剪接體在HCC、結(jié)腸癌、前列腺癌和黑色素瘤等多種惡性腫瘤組織或細(xì)胞株中過度表達(dá)，并參與G2/M檢測(cè)點(diǎn)調(diào)控[4]，G2/M檢測(cè)點(diǎn)與腫瘤發(fā)生、應(yīng)答相關(guān),所以Cdc25C可能是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[5]。梁馬可等[6]實(shí)驗(yàn)表明，Cdc25C在HCC組織、癌旁組織、正常肝臟組織表達(dá)陽性率分別為86.2%、45.8%、11.1%，三種組織中的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Cdc25C在HCC 組織中的表達(dá)與HBsAg、腫瘤直徑和腫瘤分化程度有關(guān)(P<0.05)。在肝癌細(xì)胞中，一種翻譯控制腫瘤蛋白能促進(jìn)Cdc25C的泛素化降解，從而引起周期蛋白激酶1的Tyr15位點(diǎn)去磷酸化的失敗。使Cdk1活性下降從而引起有絲分裂的停滯，造成染色體畸形，而染色體畸形是腫瘤發(fā)展中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[7]。最近還有研究人員發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素通過誘導(dǎo)p21、抑制cyclin B和蛋白Cdc25C，引起G2/M期阻滯，從而顯著抑制體外、體內(nèi)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)[8]。

為進(jìn)一步研究Cdc25C在細(xì)胞中的功能及其與腫瘤細(xì)胞惡性增殖的關(guān)系，開展抗體血清學(xué)檢測(cè)、抗體制備及其相關(guān)的研究，開發(fā)和應(yīng)用Cdc25C全蛋白抗原疫苗和肽表位疫苗，我們利用JW算法對(duì)Cdc25C的親水性及抗原性分析，結(jié)果提示該蛋白抗原性較好, 其可能抗原表位主要在氨基端殘基的部分區(qū)域。經(jīng)過折疊可能性預(yù)測(cè)和同源性檢索后，選取折疊可能性較低，同源性亦較低，同時(shí)親水性與抗原性較高的64～78、185～199、407～421三個(gè)區(qū)域肽段，采用固相合成法合成多肽。為加強(qiáng)免疫原性，在其C末端加上谷氨酸和絲氨酸，然后與KLH偶聯(lián)作為免疫原, 免疫新西蘭大白兔制備了多克隆抗體。通過ELISA分析, 結(jié)果顯示制備出的多克隆抗體滴度高，特異性好。

本實(shí)驗(yàn)制備的抗體是由多肽-血藍(lán)蛋白復(fù)合物作為免疫原，激起免疫反應(yīng)產(chǎn)生，包含了針對(duì)多肽、連接劑和載體蛋白的多克隆抗體。以該多克隆抗體對(duì)重組表達(dá)的Cdc25C融合蛋白進(jìn)行Western blotting鑒定，于73 kD附近有明顯反應(yīng)條帶，和前期研究[ 9]結(jié)果相符，說明其免疫原性是針對(duì)Cdc25C特異性多肽產(chǎn)生的。以全蛋白的單克隆抗體和多肽抗體檢測(cè)同一HCC癌旁組織，陽性反應(yīng)顆粒主要位于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，兩種抗體陽性染色結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們篩選獲得的候選多肽具有Cdc25C全蛋白一樣的抗原性，制備的多肽抗體具有和針對(duì)Cdc25C全蛋白抗體一樣的效果，此為進(jìn)一步研究Cdc25C的功能區(qū)域奠定了基礎(chǔ)。

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Preparation and application of human HCC-associated antigen Cdc25C specific peptide antibody

CHENChengxiao1,ZHANGQihui,LIChunmei,TIANLin,MOFarong

(1BeihaiPeople'sHospital,Beihai536000,China)

Abstract:ObjectiveTo prepare polyclonal antibody against human hepatocellular carcinoma (HCC)-associated antigen Cdc25C specific polypeptide, and to lay a foundation for further study of the function of Cdc25C. Methods The properties of Cdc25C protein antigen were analyzed by bioinformatics software. Several candidate partial peptides of low homology and high antigenicity were designed based on the purity, amino acid composition, length, hydrophilic and secondary structure. Three partial peptides of Cdc25C were synthesized. The synthesized peptide was then used to immunize after coupling with KLH. The activity of anti-Cdc25C antibody was analyzed by ELISA and Western blotting, and its effect was detected by immunohistochemistry. ResultsThe polypeptide antibody had high titer and specificity. The antibody identified against recombinant Cdc25C fusion protein by Western blotting, and the reaction bands appeared at 73 kD. We used the whole protein monoclonal antibody and peptide antibody to detect the same HCC cancer adjacent tissue, and its average optical density was 0.538±0.192 and 0.410±0.122, respectively, no significant difference was found between them (t=0.109, P>0.05). ConclusionPolyclonal antibody against human HCC-associated antigen Cdc25C specific polypeptide is successfully prepared. The candidate peptides obtained from the screening have the same antigenicity as Cdc25C whole protein, and the prepared polypeptide antibody has the same effect as the antibody against the Cdc25C whole protein.

Key words:liver neoplasms; hepatocellular carcinoma-associated antigen; Cdc25C polypeptide; polyclonal antibody

(收稿日期：2016-01-21)

中圖分類號(hào)：R575

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)13-0001-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.001

通信作者簡(jiǎn)介：莫發(fā)榮(1972-)，男，碩士，副教授，主要研究方向?yàn)槟[瘤免疫。E-mail:farongmo@126.com

第一作者簡(jiǎn)介：陳承曉(1978-)，女，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，主要研究方向?yàn)槟[瘤免疫。E-mail：2494255044@qq.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160264)。