許宗磊，馮桂青，蔡文芝，閆忠華，侯桂英( 聊城市人民醫(yī)院，山東聊城5000； 青島大學(xué)附屬醫(yī)院)

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CXCL12基因rs2839688位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病的關(guān)系

許宗磊1，馮桂青1，蔡文芝1，閆忠華1，侯桂英2(1 聊城市人民醫(yī)院，山東聊城252000；2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院)

摘要：目的探討CXCL12基因rs2839688位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病的關(guān)系。方法選擇冠心病患者545例，經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)一支或多支血管狹窄50%以上者279例(觀察組)，冠狀動(dòng)脈造影正常且無其他粥樣硬化證據(jù)者266例(對(duì)照組)。兩組各隨機(jī)抽取20例，采用ELISA法檢測(cè)血漿CXLC12；采集所有研究對(duì)象靜脈血，采用直接測(cè)序法檢測(cè)CXCL12基因rs2839688位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率，并分析其多態(tài)性與血漿CXLC12水平的關(guān)系。結(jié)果觀察組血漿CXCL12水平低于對(duì)照組(P<0.01)。兩組CXCL12基因rs2839688位點(diǎn)共檢測(cè)出GG、GC、CC三種基因型，觀察組三種基因型頻率分別為66.8%、28.7%、2.5%，對(duì)照組分別為69.5%、28.9%、1.5%，兩組比較P均>0.05；觀察組、對(duì)照組C等位基因分布頻率分別為16.8%、16.0%，G等位基因分別為83.2%、84.0%，兩組比較P均>0.05。兩組基因型及等位基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律。兩組各基因型者血漿CXCL12水平比較P均>0.05。結(jié)論CXCL12可能與冠心病的發(fā)生有關(guān)，但其rs2839688位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病的發(fā)病可能無關(guān)。

關(guān)鍵詞：冠心??；CXCL12基因；單核苷酸多態(tài)

趨化因子是一類能誘導(dǎo)細(xì)胞向高濃度趨化因子方向定向運(yùn)動(dòng)的小分子多肽類物質(zhì)。CXCL12是趨化因子CXC亞家族成員之一，在心肌細(xì)胞修復(fù)、血管再生以及心肌梗死后心功能恢復(fù)中具有重要作用[1，2]。CXCL12基因的蛋白產(chǎn)物能直接激活白細(xì)胞，并參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[3]，被認(rèn)為是一個(gè)與冠狀動(dòng)脈疾病相關(guān)的敏感基因。CXCL12基因rs2839688位點(diǎn)是CXCL12基因內(nèi)含子區(qū)的G→C突變，但迄今鮮見其與冠心病(CAD)相關(guān)的報(bào)道。本研究探討CXCL12基因rs2839688位點(diǎn)多態(tài)性與CAD的關(guān)系。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇聊城市人民醫(yī)院2013年11月～2014年9月收治的CAD患者279例(觀察組)，男152例、女127例，年齡(54.23±8.45)歲，BMI 26.57±3.43。冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)左前降支、左回旋支、右冠狀動(dòng)脈及主要分支中至少一支主要冠狀動(dòng)脈直徑狹窄超過50%。同期另選因胸痛入院，但無血管疾病及冠狀動(dòng)脈主支狹窄患者266例(對(duì)照組)，男132例、女134例，年齡(53.46±10.42)歲，BMI25.49±8.26。兩組均排除罹患肝、腎、甲狀腺、血液系統(tǒng)疾病及腫瘤者；存在感染狀態(tài)、自身免疫系統(tǒng)疾病、1型糖尿病及家族性高脂血癥者。兩組性別、年齡、BMI具有可比性。

1.2血漿CXCL12水平檢測(cè)兩組隨機(jī)抽取20例患者，均于入院24 h內(nèi)采集空腹靜脈血3 mL，EDTA抗凝，30 min內(nèi)以3 000 r/min離心20 min，留取血漿，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測(cè)血漿CXCL12水平。所有操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.3CXCL12基因rs2839688位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)①DNA提取：兩組均空腹抽取肘靜脈血5 mL，EDTA抗凝，DNA提取試劑盒提取基因組DNA。②PCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增rs2839688位點(diǎn)及其側(cè)翼區(qū)。采用Gene Runner5.0設(shè)計(jì)引物。上游引物：5′-GAACTACTACGAGCACAGCAGG-3′，下游引物5′-GTACCCAGCTGAGATCTTCCTG-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系50 μL，包括2×Taq Master Mix 25 μL、上下游引物各2 μL、基因組DNA 2 μL、去離子水19 μL。在PCR熱循環(huán)儀完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度398 bp，取7 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，150 V電壓下電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量。③多態(tài)性檢測(cè)：將目的DNA片段送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。

2結(jié)果

2.1兩組血漿CXCL12水平比較觀察組血漿CXCL12水平為(2.78±0.15)ng/mL，對(duì)照組為(5.27±0.19)ng/mL，兩組比較P<0.01。

2.2CXCL12基因rs2839688位點(diǎn)多態(tài)性CXCL12基因rs2839688位點(diǎn)多態(tài)性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為288 bp。CXCL12基因rs2839688位點(diǎn)存在三種基因型，即GG、GC、CC型。

2.3兩組基因型及等位基因頻率比較兩組CXCL12基因rs2839688位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。兩組CXCL12基因rs2839688位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較見表1。

表1　　　　兩組CXCL12基因rs2839688位點(diǎn)基因型

2.4CXCL12基因rs2839688位點(diǎn)多態(tài)性與血漿CXCL12水平的關(guān)系隨機(jī)抽取兩組GG、GC型者血漿各15例份，及全部CC型者血漿。觀察組GG、GC、CC型者血漿CXCL12水平分別為(5.00±0.18)、(5.31±0.19)、(5.44±0.33)ng/mL，對(duì)照組分別為(2.94±0.16)、(2.85±0.13)、(2.83±0.29)ng/mL。兩組各基因型者血漿CXCL12水平比較P均>0.05。

3討論

CAD是世界范圍內(nèi)患病率和病死率最高的疾病之一，其特征性病變?yōu)閯?dòng)脈粥樣硬化。大量研究表明，單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞參與血管壁的免疫反應(yīng)，細(xì)胞免疫、體液免疫及機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)均參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成及發(fā)展[4～6]。趨化因子在血漿中普遍存在，且在炎癥免疫反應(yīng)中起主導(dǎo)作用，然而不同的趨化因子在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成及其穩(wěn)定性方面發(fā)揮不同的作用[7]，如CXCL16促進(jìn)斑塊形成及斑塊不穩(wěn)定[8]，CCL21可通過其受體CCR7抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[9]。研究表明，趨化因子的基因多態(tài)性，如CXCL16基因第4內(nèi)含子的rs3744700位點(diǎn)多態(tài)性與CAD有關(guān)，GG基因型是CAD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[8]； CCL21 基因 rs2812377位點(diǎn) G 等位基因頻率在CAD組明顯高于對(duì)照組，推測(cè)其為CAD發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10]。因此認(rèn)為，趨化因子及其基因多態(tài)性可能在CAD的預(yù)防及治療中具有重要作用。

CXCL12是一個(gè)多效性趨化因子，廣泛表達(dá)于多種組織中，如心肌細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等[11]。CXCL12可誘導(dǎo)成熟及未成熟造血細(xì)胞的增殖與分化，促進(jìn)干細(xì)胞的增殖及歸巢，參與多種病理生理過程[12]。Yamaguchi等[13]研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12可通過激活PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路募集內(nèi)皮祖細(xì)胞從而促進(jìn)血管新生，在血管損傷及心血管疾病的修復(fù)過程中起至關(guān)重要的作用。研究表明，血小板活化可加重動(dòng)脈粥樣硬化的形成，而人體內(nèi)CXCL12水平直接抑制血小板活化程度[14]。因此，CXCL12水平升高可抑制CAD的發(fā)生、發(fā)展。研究表明，CXCL12在心肌細(xì)胞修復(fù)、血管再生以及心肌梗死后左心室功能恢復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。使用CXCL12類似物干預(yù)心肌梗死后心肌病大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCL12可通過改善模型大鼠梗死區(qū)域膠原沉積、促進(jìn)梗死區(qū)域血管生成，進(jìn)而恢復(fù)梗死部位心肌細(xì)胞的性能，提高心臟功能[14]。本研究觀察組血漿CXCL12水平顯著低于對(duì)照組，表明血漿CXCL12水平降低可促進(jìn)CAD的發(fā)生。

CAD是由遺傳因素、環(huán)境因素等多種因素共同作用的多基因遺傳性疾病。CXCL12基因位于人類第9號(hào)染色體p13.3，基因全長(zhǎng)1 144 bp，含有4個(gè)外顯子，編碼110個(gè)氨基酸。Akhtar等[1]研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12基因rs1746048位點(diǎn)可能對(duì)急性心肌梗死的早期診斷提供幫助，但尚未發(fā)現(xiàn)CXCL12基因rs1746048位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率在急性心肌梗死患者和正常人群中的差異。CXCL12存在多個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，本研究?jī)山MCXCL12基因rs2839688位點(diǎn)基因型、等位基因分布頻率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明CXCL12基因rs28396887位點(diǎn)多態(tài)性與CAD或CAD病變程度無相關(guān)性。上述結(jié)果產(chǎn)生原因可能與rs2839688位點(diǎn)位于CXCL12基因第二內(nèi)含子區(qū)，此區(qū)為非功能區(qū)，該位點(diǎn)變異可能不影響CXCL12蛋白編碼有關(guān)；亦可能與本研究樣本量較小有關(guān)。

綜上所述，血漿CXCL12水平升高可抑制CAD的發(fā)生，但其rs2839688位點(diǎn)多態(tài)性與CAD的發(fā)病可能無關(guān)。

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(收稿日期：2015-12-19)

中圖分類號(hào)：R541

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1002-266X(2016)12-0049-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.016