杜文濤，白凈，智華(河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，河北邯鄲056002)

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冠心病患者心外膜脂肪體積及脂肪組織基質(zhì)蛋白酶2表達、磷脂酶A2水平及意義

杜文濤，白凈，智華(河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，河北邯鄲056002)

摘要：目的檢測冠心病患者心外膜脂肪體積(EATV)及心外膜脂肪組織基質(zhì)蛋白酶2(MMP-2)表達、磷脂酶A2(PLA2)水平，分析其意義。方法選擇行心臟手術(shù)患者113例，其中冠心病患者67例(冠心病組)，心臟瓣膜病患者(瓣膜病組)46例。術(shù)前均行雙源CT檢查，測量EATV，評價冠狀動脈斑塊性質(zhì)，判斷是否發(fā)生血管正性重構(gòu)；術(shù)中取心外膜脂肪組織及胸腔脂肪組織，檢測脂肪組織MMP-2 mRNA、MMP-2蛋白表達及PLA2水平。分析冠心病患者發(fā)生血管正性重構(gòu)的影響因素。結(jié)果冠心病組EATV為(128.08±45.34)cm3、瓣膜病組為(84.21±25.37)cm3，兩組發(fā)生血管正性重構(gòu)者分別為36、10例，兩組比較P均<0.01。冠心病組心外膜脂肪組織MMP-2 mRNA、MMP-2蛋白表達及PLA2水平均明顯高于瓣膜病組(P均<0.05)，兩組胸腔脂肪組織上述指標比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。EATV、MMP-2、PLA2、高血壓是冠心病患者發(fā)生血管正性重構(gòu)的影響因素(P<0.05或<0.01)。結(jié)論冠心病患者EATV增大，心外膜脂肪組織MMP-2高表達、PLA2水平增加；EATV、MMP-2、PLA2是冠心病患者發(fā)生血管正性重構(gòu)的影響因素。

關(guān)鍵詞：冠狀動脈粥樣硬化；基質(zhì)金屬蛋白酶2；磷脂酶A2；心外膜脂肪；血管正性重構(gòu)

冠心病是由各種原因?qū)е碌墓跔顒用}發(fā)生粥樣硬化，造成冠狀動脈進行性狹窄或阻塞，臨床上尤以高血壓、高血脂、糖尿病等患者易發(fā)[1]。心外膜脂肪組織沉積于心臟及冠狀動脈周圍，含有單核細胞及巨噬細胞，可以旁分泌方式刺激炎癥細胞分泌炎性因子，在內(nèi)皮沉積、斑塊形成過程中發(fā)揮重要作用[2,3]。磷脂酶A2(PLA2)及基質(zhì)蛋白酶2(MMP-2)是體內(nèi)常見的炎癥介質(zhì)，與冠心病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。本研究檢測冠心病患者心外膜脂肪體積(EATV)及心外膜脂肪組織MMP-2表達、PLA2水平，分析其意義。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2012年1月～2015年7月河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院收治的行心臟手術(shù)患者113例，其中冠心病患者67例(冠心病組)，均符合2012年美國穩(wěn)定性心臟病指南診斷標準，男27例、女40例，年齡(56.96±3.72)歲；心臟瓣膜病患者46例(瓣膜病組)，均符合2014 年心臟瓣膜病患者管理指南診斷標準，男25例、女21例，年齡(56.14±3.11)歲。兩組性別比、年齡具有可比性。兩組均于手術(shù)中切取前室間溝脂肪組織(心外膜脂肪)及心包外胸腔內(nèi)脂肪組織(胸腔脂肪)。排除標準：身體狀況不能耐受手術(shù)，合并有其他系統(tǒng)嚴重疾病，合并有系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署手術(shù)知情同意書。

1.2相關(guān)指標觀察

1.2.1EATV兩組均接受64排雙源CT(德國西門子)檢查，通過Volumer 軟件測量 EATV。測量前5～10 min靜脈注射碘造影劑，口服硝酸甘油以擴張冠狀動脈，口服美托洛爾片控制HR在60次/min 左右。選取心包橫竇中點左肺動脈起源處開始至左心室心尖部下緣可辨認的心臟纖維膜(即心外膜邊界)[5]，由Volumer軟件生成選取區(qū)域的脂肪體積(cm3)，通過Circulation軟件進行分析。將CT測量值為-250～-30 HU的組織定義為脂肪組織[6,7]。

1.2.2血管正性重構(gòu)根據(jù)雙源CT檢測數(shù)據(jù)，計算血管重構(gòu)指數(shù)(RI)。RI=病變處血管外彈力膜面積/參照部位血管面積。RI≥1 為正性重構(gòu)(擴張性重構(gòu))。

1.2.3心外膜及胸腔脂肪組織MMP-2 mRNA及蛋白表達①MMP-2 mRNA：采用RT-qPCR方法。提取心外膜及胸腔脂肪組織總 RNA并純化，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板，分別以 MMP-2和β-actin進行引物擴增，經(jīng)ABI7500 RT-qPCR儀行 SYBRGreen 染料熒光定量。采用2-ΔΔCt法計算MMP-2 mRNA的相對表達量，重復(fù)3次，取平均值。②MMP-2蛋白：采用Western blotting法。按照總蛋白提取試劑盒說明書提取心外膜及胸腔脂肪組織蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取50 μg蛋白進行10%聚丙烯酰胺電泳，電泳完畢將蛋白轉(zhuǎn)至甲醛浸泡后的PVDF膜上。用5%脫脂奶粉-TBST溶液室溫封閉2 h，一抗為 MMP-2兔抗人多克隆抗體(1∶1 000)，內(nèi)參為β-actin兔抗人多克隆抗體。采用 BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)分析圖像，Image J 軟件測定灰度值，計算相對表達量。

1.2.4心外膜及胸腔脂肪組織PLA2水平分別取心外膜及胸腔脂肪組織1 g，加入2 mL生理鹽水，搗碎，1 000 r/min離心10 min，取上清液，采用PLA2熒光定量檢測試劑盒(上海撫生生物科技公司)檢測PLA2，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.5冠心病患者血管正性重構(gòu)的影響因素分析收集冠心病組發(fā)生血管正性重構(gòu)與未發(fā)生血管重構(gòu)者性別、年齡、血糖、血脂、斑塊性質(zhì)、EATV、心外膜脂肪組織MMP-2及PLA2等資料，分析發(fā)生血管正性重構(gòu)的影響因素。根據(jù)雙源CT結(jié)果評價斑塊性質(zhì)。測量狹窄程度最嚴重血管的斑塊，每個斑塊選取3個區(qū)域進行測量，按最小CT值進行分類。軟斑塊：最小CT值范圍為-42～47 HU；纖維斑塊：最小CT值范圍為61～112 HU；鈣化斑塊：最小CT值范圍為126～736 HU。

2結(jié)果

2.1兩組EATV比較冠心病組EATV為(128.08±45.34)cm3，瓣膜病組為(84.21±25.37)cm3，兩組比較P<0.01。

2.2兩組血管正性重構(gòu)情況比較冠心病組發(fā)生血管正性重構(gòu)者36例，瓣膜病組為10例，兩組比較P<0.01。

2.3兩組心外膜及胸腔脂肪組織MMP-2 mRNA、MMP-2蛋白表達及PLA2水平比較冠心病組心外膜脂肪組織MMP-2 mRNA、MMP-2蛋白表達及PLA2水平均明顯高于瓣膜病組(P均<0.05)，兩組胸腔脂肪組織上述指標比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

2.4冠心病患者發(fā)生血管正性重構(gòu)的影響因素冠心病組發(fā)生血管正性重構(gòu)者BMI、LDL、EATV及心外膜脂肪組織MMP-2 mRNA、MMP-2蛋白、PLA2均高于未發(fā)生正性重構(gòu)者，纖維斑塊體積、鈣化斑塊體積均低于未發(fā)生正性重構(gòu)者，兩者比較P<0.05或<0.01；見表2。冠心病組發(fā)生血管正性重構(gòu)者伴有高血壓25例，未發(fā)生正性重構(gòu)者為12例，兩者比較P<0.05。冠心病組發(fā)生與未發(fā)生血管正性重構(gòu)者間性別比、年齡、空腹血糖、吸煙、軟斑塊體積、HDL、TC、TG比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。多因素Logostic回歸分析結(jié)果顯示，EATV、MMP-2、PLA2、高血壓是冠心病患者發(fā)生血管正性重構(gòu)的獨立影響因素(P<0.05或<0.01)；見表3。

表1　　　　兩組心外膜及胸腔脂肪組織MMP-2 mRNA、

注：與瓣膜病組相同組織比較，*P<0.05。

表2　冠心病組發(fā)生血管正性重構(gòu)與非正性重構(gòu)者相關(guān)資料比較

注：與非正性重構(gòu)組比較，*P<0.05，△P<0.01。

表3　　　　冠心病患者發(fā)生血管正性重構(gòu)影響因素的多因素

3討論

動脈粥樣硬化血管常由于血管內(nèi)膜損傷，脂質(zhì)在破損處沉積，導(dǎo)致管壁逐漸變厚，進而失去正常血管彈性，管腔逐漸狹窄；在疾病進展過程中常合并多種病變，包括脂質(zhì)積聚、內(nèi)膜增生、斑塊纖維化或鈣化，并伴有動脈中層彈性減退，繼而發(fā)生斑塊破裂、血栓形成[8,9]。心外膜下脂肪作為更靠近心臟的內(nèi)臟脂肪，能夠通過多種方式對心臟結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，EATV與冠心病發(fā)生及狹窄程度相關(guān)，其水平增加導(dǎo)致臨床心血管事件發(fā)生率增加[10,11]。

冠心病患者冠狀動脈斑塊的易損性是斑塊破裂、出血進而引起心血管事件的重要機制[12]。目前關(guān)于EATV及心外膜脂肪組織炎癥介質(zhì)分泌與冠狀動脈斑塊易損性的研究較少。本研究我們選用瓣膜病并行手術(shù)治療的患者作為對照組，是因為此病例可行手術(shù)取心外膜脂肪組織，同時其冠狀動脈出現(xiàn)粥樣斑塊概率較低，與正常人相似。本研究結(jié)果顯示，冠心病患者EATV及心外膜脂肪組織炎癥因子MMP-2表達、PLA2水平均高于瓣膜病組，且EATV及心外膜脂肪組織MMP-2高表達、PLA2水平升高是冠心病患者發(fā)生血管正性重構(gòu)的獨立危險因素。血管重構(gòu)是血管受管內(nèi)壓力、生長因子、血管活性物質(zhì)等作用，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞增生、炎癥細胞聚集及細胞外基質(zhì)降解，是影響動脈粥樣硬化血管管腔面積的重要因素。心外膜脂肪組織由巨噬細胞等構(gòu)成，巨噬細胞可產(chǎn)生MMP，當血管重構(gòu)導(dǎo)致內(nèi)皮增生和基質(zhì)降解時，大量巨噬細胞積聚，導(dǎo)致MMP分泌增加，繼而促進血管生成因子分泌增加[13]。MMP-2能夠促進細胞外基質(zhì)降解，在斑塊形成后促進血管平滑肌增生和遷移[14]。MMP-2降解細胞外基質(zhì)后，炎癥因子和內(nèi)皮下新生血管更容易進入血管內(nèi)膜，增加動脈粥樣硬化斑塊的易損性[15]。PLA2在血液循環(huán)中常與LDL結(jié)合，水解內(nèi)皮下氧化低密度脂蛋白，產(chǎn)生游離溶血卵磷脂和氧化型游離脂肪酸，進一步損傷血管內(nèi)皮，誘導(dǎo)循環(huán)中單核細胞向內(nèi)膜不斷聚集，進而生成巨噬細胞。巨噬細胞又能夠在吞噬氧化低密度脂蛋白后成為泡沫細胞，后者能夠增加斑塊的不穩(wěn)定性[16]。除此之外，PLA2還能增強LDL與MMP的結(jié)合，并增強其基質(zhì)降解作用，最終導(dǎo)致冠心病的發(fā)生。

已有大量臨床試驗證實，高血壓與急性冠脈綜合征明顯相關(guān)，提示高血壓能夠使冠狀動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性增加[17～19]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，高血壓是冠心病患者發(fā)生血管正性重構(gòu)的獨立危險因素。在高血壓發(fā)生、發(fā)展過程中，由于壓力對內(nèi)膜的機械性損傷以及體內(nèi)各種神經(jīng)體液因子對血管的作用，斑塊易損性增加，繼而發(fā)生斑塊破裂、出血或血栓形成，進一步導(dǎo)致心肌缺血或梗死。

本研究的缺陷為樣本量小，結(jié)果缺乏一定的說服力；觀察斑塊性質(zhì)采用的是雙源CT，效果不及血管內(nèi)超聲(IVUS)。但IVUS對設(shè)備及人員要求較高，且費用高，開展尚有一定困難。

綜上所述，冠心病患者EATV增加，心外膜脂肪組織MMP-2高表達、PLA2水平增加；EATV、MMP-2、PLA2是冠心病患者發(fā)生血管正性重構(gòu)的影響因素。

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Epicardial adipose tissue volume and MMP-2 and PLA2levels in epicardial adipose tissues of patients with coronary artery disease

DUWentao,BAIJing,ZHIHua

(AffiliatedHospitalofHebeiUniversityofEngineering,Handan056002,China)

Abstract:ObjectiveTo detect the content of epicardial adipose tissue volume (EATV) and the levels of matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) and phospholipase A2 (PLA2) in the epicardial adipose tissues of patients with coronary heart disease (CHD) and to analyze the significance. MethodsA total of 113 patients receiving thoracic surgery were collected, including 67 patients with coronary heart disease (CHD group) and 46 cases with heart valve disease (valvular disease group). EATV and the nature of the plaque were detected by dual-source CT before surgery to determine whether vascular positive remodeling happened. Then, epicardial adipose tissue (EAT)and intrathoracic adipose tissue (TAT)were collected. MMP-2 mRNA and protein levels were detected by RT-PCR and Western blotting. The PLA2 level was detected by ELISA. Finally, the factors related to vascular positive remodeling were analyzed by the logistic regression. ResultsThe EATV in the CHD group was (128.08±45.34) cm3, and (84.21±25.37) cm3 in the valvular disease group. There were respectively 36 and 10 cases of vascular positive remodeling in the two groups (all P<0.01). The MMP-2 mRNA and protein expression levels, PLA2 in EATV of the CHD group were significantly higher than those of the valvular disease group (all P<0.05), but the differences of the above indexes were not statistically significant in the thoracic adipose tissues (all P>0.05). EATV, MMP-2, PLA2 and high blood pressure were the independent risk factors for the development of vascular positive remodeling in CHD patients. ConclusionsThe levels of EATV, MMP-2 and PLA2 in the epicardial adipose tissues of CHD patients were increased. EATV, MMP-2 and PLA2 were the independent risk factors for the development of vascular positive remodeling in CHD patients.

Key words:atherosclerosis; matrix metalloproteinase 2; phospholipase A2; epicardial adipose tissue; vascular positive remodeling

(收稿日期：2015-09-01)

中圖分類號：R654.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)12-0024-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.007

第一作者簡介：杜文濤(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要研究方向為冠心病的診斷及治療。E-mail: 1961147104@qq.com