崔曉騰，高星杰，張春燕，付雪，蘇超，任媛媛，楊潔(天津醫(yī)科大學，天津 300070)

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pmCherry-C1-Argonaute1重組質粒的構建及鑒定

崔曉騰，高星杰，張春燕，付雪，蘇超，任媛媛，楊潔(天津醫(yī)科大學，天津 300070)

摘要：目的構建并鑒定pmCherry-C1-Argonaute1重組質粒，為深入研究Argonaute1蛋白在細胞應激及相關疾病的生物學作用奠定基礎。方法提取HeLa細胞總RNA，反轉錄出含Argonaute1的cDNA；以Argonaute1 cDNA為模板，采用PCR法擴增出帶有EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切的目的基因；采用雙酶切法將目的片段連接到pmCherry-C1載體上；將構建成功的pmCherry-C1-Argonaute1重組質粒轉染入HeLa細胞內(nèi)，以Western blotting法檢測Argonaute1與櫻桃紅(Cherry)蛋白的融合表達情況；以激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)Argonaute1蛋白與細胞應激顆粒的標記蛋白(G3BP)及加工體的標記蛋白(DCP1α)的應激共定位關系。結果以EcoRⅠ、BamHⅠ單、雙酶切及基因測序法鑒定構建的重組質粒無誤；融合蛋白表達陽性；當細胞受到應激時，Argonaute1蛋白與G3BP、DCP1α蛋白共定位。結論本研究成功構建重組pmCherry-C1-Argonaute1質粒。該質粒可有效表達Cherry標記的Argonaute1融合蛋白，有助于深入研究Argonaute1蛋白在細胞應激及相關疾病領域的生物學作用。

關鍵詞：人類Argonaute1蛋白；pmCherry-C1；重組質粒；融合蛋白；應激顆粒

應激蛋白Argonaute1是一種多功能蛋白，參與RNA干擾及應激顆粒(SGs)、加工體(PBs)形成等多種細胞生物學過程[1～3]。pmCherry-C1是一種可以編碼紅色熒光蛋白的真核表達載體。2015年9～11月，本研究通過基因工程技術將Argonaute1基因片段連接至pmCherry-C1載體，構建pmCherry-C1-Argonaute1重組質粒，旨在為深入研究Argonaute1蛋白的細胞生物學功能提供便利工具。

1材料與方法

1.1材料質粒、菌株及細胞： pmCherry-C1載體由Johan Perane博士饋贈，感受態(tài)大腸桿菌Trans1購自天津科儀嘉欣科技有限公司，HeLa細胞來自本實驗室。酶類及主要生化試劑：限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4 DNA 連接酶均購自Thermo Fisher Scientific公司，Taq酶購自北京鼎國昌盛生物技術公司，T/A載體(pEASY-T1)購自北京全式金生物技術有限公司，B型小量DNA快速回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限公司，質?？焖偬崛≡噭┖匈徸员本┧鱽韺毧萍加邢薰?，去內(nèi)毒素質粒提取試劑盒購自Promega公司，Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，BCA蛋白檢測試劑盒購自Pierce公司，LumiGLo化學發(fā)光底物購于KPL公司?？贵w：兔抗人Argonaute1單克隆抗體購自CST公司，鼠抗人G3BP單克隆抗體和兔抗人DCP1α抗體購自abcam公司，鼠抗人櫻桃紅蛋白(Cherry)單克隆抗體購自MBL公司，藍色熒光(Alexa Fluor 350)標記的驢抗鼠熒光二抗和綠色熒光(Alexa Fluor 488)標記的驢抗兔熒光二抗購自Invitrogen公司，辣根過氧化物酶標記的抗鼠和抗兔IgG二抗購自KPL公司。引物合成及基因測序由北京天一輝遠公司完成。

1.2pmCherry-C1-Argonaute1重組質粒構建

1.2.1Argonaute1蛋白目的片段獲取提取HeLa細胞的總RNA，以TGGACCAAAAGGGGCAGCACTGGTGCCC序列進行Argonaute1的cDNA擴增；根據(jù)CDS序列(NM_012199.2)設計含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位點的引物序列，即 F：5′-CCGGAATTCCATGGAAGCGGGACCCTCGGGAG-3′;R：5′-CGCGGATCCTCAAGCGAAGTACATGGTGCGC-A-3′；以反轉錄的Argonaute1 cDNA為模板，擴增PCR目的片段，條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s、65 ℃ 45 s、72 ℃ 3 min，共15個循環(huán)，每次循環(huán)降低1 ℃，再以50 ℃進行20個循環(huán)，72 ℃延伸10 min；將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒回收目的片段，并將目的片段與pEASY-T1(T/A載體)于25 ℃連接15 min。連接產(chǎn)物轉化Tran1-T1感受態(tài)細胞，置于含有氨芐/卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴增并提取質粒。以EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，凝膠回收試劑盒回收并純化目的片段。

1.2.2線性pmCherry-C1質粒載體獲取以質粒快速小提試劑盒提取pmCherry-C1質粒，進行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，完整切下呈線性的pmCherry-C1質粒載體，以1%瓊脂糖電泳分離，再以凝膠回收試劑盒回收pmCherry-C1線性載體(約4 700 bp)。 在T4 DNA連接酶作用下，將線性pmCherry-C1質粒載體與具有相同黏性末端的Argonaute1功能片段于22 ℃下連接并過夜。連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細菌大腸桿菌Trans1，在含有卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴增并提取重組質粒。

1.3pmCherry-C1-Argonaute1重組質粒鑒定

1.3.1酶切及基因測序采用EcoRⅠ和BamHⅠ對重組質粒pmCherry-C1-Argonaute1進行單、雙酶切鑒定，并以1%瓊脂糖凝膠電泳驗證片段大??；同時對重組質粒進行基因測序鑒定。

1.3.2融合蛋白檢測采用Western blotting法。以預冷的1×NP-40裂解液裂解細胞，超聲破碎細胞后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清獲取全細胞裂解液，以BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。裂解液中加入SDS上樣緩沖液(pH 6.8的50 mmol/L Tris-Cl、2% SDS、0.1%溴酚藍、10%甘油、2.5% β-巰基乙醇)，99 ℃熱變性10 min，8% SDS-PAGE電泳；以半干轉法將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉3 h；加入兔抗人Argonaute1單克隆一抗或鼠抗Cherry一抗，4 ℃孵育過夜；TBST 溶液洗膜3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標記的抗鼠IgG二抗室溫孵育2 h；TBST溶液再次洗膜3次，每次10 min；加入LumiGLo化學發(fā)光底物后暗室曝光。

1.3.3三色熒光共定位分析以去內(nèi)毒素質粒提取試劑盒提取無內(nèi)毒素重組質粒。將細胞接種于激光共聚焦皿中，以含10 % FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞達80%融合時，進行脂質體瞬時轉染pmCherry-C1-Argonaute1重組質粒。轉染后48 h給予0.5 mmol/L亞砷酸鹽處理1 h，以4%多聚甲醛室溫固定10 min，以高壓過的PBS緩沖液洗滌2次、5 min/次。以1%通透液(含0.2% Triton X-100的PBS)室溫靜置通透10 min；加入1% BSA封閉1 h；加入G3BP(1∶250)和DCP1α(1∶100)一抗混合液，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次，10 min/次；加入藍色熒光標記驢抗鼠(1∶800)與綠色熒光標記驢抗兔(1∶800)二抗混合液，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次，10 min/次。以不含DAPI的細胞熒光封片液封片并過夜，以激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)紅、綠、藍三色熒光信號。

2結果

2.1Argonaute1目的片段PCR擴增目的片段長度約為2 574 bp，見圖1。

注：1為DNA Marker；2為PCR產(chǎn)物。

2.2線性pmCherry-C1質粒載體完整的線性pmCherry-C1質粒載體(見圖2)經(jīng)EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后，在4 722 bp左右出現(xiàn)條帶(圖3)，純化回收后用于后續(xù)的連接反應。

圖2　pmCherry-C1 質粒圖譜

注：1為DNA Marker；2為pmCherry-C1質粒；3為EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后產(chǎn)物。

圖3線性pmCherry-C1質粒載體

2.3重組真核表達質粒pmCherry-C1-Argonaute1 鑒定結果

2.3.1酶切及基因測序將構建的重組質粒分別進行EcoRⅠ和BamHⅠ的單、雙酶切，產(chǎn)生的條帶大小與預期相符(見圖4)，重組質粒基因測序結果正確，證明Argonaute1功能片段已成功插入到pmCherry-C1的多克隆位點上。

注：1為DNA Marker；2為pmCherry-C1-Argonaute1質粒；3為EcoRⅠ單酶切產(chǎn)物；4為BamH Ⅰ單酶切產(chǎn)物；5為EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切產(chǎn)物。

圖4重組真核表達質粒pmCherry-C1-Argonaute1的

EcoRⅠ、BamHⅠ單、雙酶切產(chǎn)物

2.3.2融合蛋白表達Argonaute1蛋白、Cherry蛋白融合后分子量為89.7 KDa，Western blotting法檢測的蛋白條帶與目的融合蛋白分子量相符(見圖5)，表明Cherry-Argonaute1融合蛋白表達成功。

圖5　Western blot法檢測融合蛋白結果

2.3.3三色熒光共定位轉染構建的重組質粒pmCherry-C1-Argonaute1，可在細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)熒光信號，當細胞受到氧化應激時Cherry-Argonaute1可在胞質內(nèi)形成紅色的顆粒狀結構，與SGs的標志蛋白G3BP(藍色)、PBs的標志蛋白DCP1α(綠色)顆粒結構均呈共定位關系。見圖6。

圖6　　　　激光共聚焦顯微鏡下觀察重組質粒

3討論

Argonaute1蛋白家族是一類相對分子量約為100 KDa的序列保守蛋白，表達于人、果蠅、擬南芥等多個物種[4～6]。Argonaute1蛋白家族包括多個成員，多含有月牙狀的PAZ和具有潛在核酸內(nèi)切酶活性的PIWI結構域，參與miRNA、siRNA、piRNA等多個非編碼小RNA的細胞生物學過程[6～8]。研究發(fā)現(xiàn)，Argonaute1是RNA誘導沉默復合體的核心元件，與siRNA生成、靶mRNA降解、細胞應激等過程密切相關[1,6]。

生物體的生存環(huán)境復雜多變，機體細胞為應對氧化應激、滲透壓休克、熱休克、紫外線輻射和病毒感染等多種外界刺激而建立相應的“應激反應體系”，以保持細胞旺盛的生命力。轉錄后基因調控機制是其中至關重要的環(huán)節(jié)，它可調控胞質內(nèi)RNA代謝、暫時抑制應激細胞中蛋白的翻譯過程、節(jié)省細胞內(nèi)合成代謝的原料和能量、優(yōu)先表達應激所特需的蛋白等[9]。SGs和PBs是細胞受到應激時在胞質內(nèi)形成的與RNA代謝密切相關的顆粒狀結構[10～12]。這兩種顆粒結構實質上是一系列蛋白、核酸的聚集體。隨著研究的深入，不斷有新的應激蛋白被發(fā)現(xiàn)[10]。其中，Argonaute1蛋白同時參與細胞中SGs和PBs的形成[13～15]。通過基因工程的方法對Argonaute1蛋白進行熒光蛋白標記，可用于探討Argonaute1蛋白在細胞應激中的作用。Cherry是四聚體Discosoma sp.紅色熒光蛋白的一個突變體，熒光強度及抗光漂白能力均有所提高。pmCherry-C1載體允許目的基因片段插入Cherry蛋白基因的C端，形成紅色熒光標記的目的蛋白。本研究通過構建pmCherry-C1-Argonaute1重組質粒的方法對Argonaute1蛋白進行Cherry的熒光標記。在Western blotting實驗中發(fā)現(xiàn)，利用抗內(nèi)源性Argonaute1抗體可以檢測出兩個條帶，而抗Cherry抗體檢測出一個條帶，表明pmCherry-C1-Argonaute1重組質粒能夠在活細胞內(nèi)成功表達Cherry與Argonaute1的融合蛋白。當細胞受到亞砷酸鹽氧化應激刺激時，Cherry標記的Argonaute1蛋白可與應激顆粒(以G3BP蛋白為標記蛋白)和加工體(以DCP1α為標記蛋白)均呈共定位關系，說明Argonaute1蛋白為細胞應激和加工體的共同成員。

總之，本研究成功構建了重組pmCherry-C1-Argonaute1質粒，其可有效表達Cherry標記的Argonaute1融合蛋白；上述結果有助于深入研究Argonaute1蛋白在細胞應激及相關疾病研究領域的生物學作用機制。

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Construction and identification of recombinant plasmid pmCherry-C1-Argonaute1

CUIXiaoteng,GAOXingjie,ZHANGChunyan,FUXue,SUChao,RENYuanyuan,YANGJie

(TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:ObjectiveTo construct and identify the recombinant plasmid pmCherry-C1-Argonaute1 and to provide the basis for further research on the biological role of Argonaute1 protein in the field of cell stress and its related diseases. MethodsThe total RNA was extracted from Hela cells and cDNA containing Argonaute1 was inverse transcribed. Argonaute1 fragment containing EcoRI and BamHI site was amplified by PCR from purified tamplate from HeLa cell line and inserted into pmCherry-C1 fluorescent expressing vector. The recombinant pmCherry-C1-Argonaute1 plasmid was transfected into HeLa cells and the expression of red fluorescent fusion proteins was examined by Western blotting and the co-localization in stress condition of Argonaute1 and G3BP (biomarker in stress granules) and DCP1α (biomarker in processing bodies) was detected by fluorescence microscope. ResultsThe recombinant plasmid was sequenced correctly which was identified by EcoRI, BamHI, the restriction single/double enzyme digestion and gene sequencing. The red fluorescent fusion protein was also detected in transfected HeLa cell by Western blotting. The result of three-color immunofluorescence co-localization indicated that Cherry-red labeled Argonaute1 was co-localized with G3BP and DCP1α in cells under stress condition. ConclusionsThe recombinant eukaryotic plasmid of pmCherry-C1-Argonaute1 is constructed successfully and expresses Cherry-red labeled Argonaute1 fusion protein effectively . These results will help to study the biological role of Argonaute1 in cell stress and related diseases.

Key words:human Argonaute1 protein; pmCherry-C1; recombinant plasmid; fusion protein; stress granules

(收稿日期：2016-01-06)

中圖分類號：Q591.2,Q784

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)12-0009-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.003

通信作者簡介：楊潔(1968-)，女，博士生導師，教授，主要研究方向為細胞生物學、細胞分子通路。E-mail: yangj@tijmu.edu.cn

第一作者簡介：崔曉騰(1990-)，男，碩士研究生，主要研究方向為細胞生物學。E-mail: xiaotengcui@gmail.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(31370749/31571380)；國家杰出青年基金資助項目(31125012)；教育部“創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”(IRT13085)；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(15JCQNJC09900)。