張　瑜 張慶霞/北京信得威特科技有限公司吳娟/北京市通州區(qū)農(nóng)業(yè)局

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微量血凝及血凝抑制試驗(yàn)在實(shí)際操作中關(guān)鍵點(diǎn)解析

張瑜 張慶霞/北京信得威特科技有限公司
吳娟/北京市通州區(qū)農(nóng)業(yè)局

在獸醫(yī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中，血凝試驗(yàn)（HA）主要用來測(cè)定抗原的血凝價(jià)以及是否存在血凝性抗原，血凝抑制試驗(yàn)（HI）則作為一種抗體監(jiān)測(cè)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)、獸醫(yī)門診、大中型養(yǎng)禽場(chǎng)。在實(shí)際應(yīng)用中，HA和HI試驗(yàn)可用于病毒分離、鑒定、分型，檢測(cè)抗原抗體、免疫鑒定等等，例如：養(yǎng)禽場(chǎng)常常將禽流感、新城疫、減蛋綜合癥等疫苗免疫后的抗體水平，作為衡量免疫程序是否合理的依據(jù)。盡管此法操作簡便、快速、準(zhǔn)確、實(shí)用，但在實(shí)踐中也常常由于某些因素的影響，從而使試驗(yàn)結(jié)果不精確，有時(shí)甚至無法判定結(jié)果。本文主要對(duì)HA和HI在實(shí)際操作中的關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行闡述。

一、材料的準(zhǔn)備及儀器校準(zhǔn)

HA和HI試驗(yàn)中用到的槍頭、EP管、采血管、PBS必須全部高壓滅菌。注射器必須是新開封，PBS必須在高壓之前標(biāo)定PH=7.2，單槍、排槍必須校準(zhǔn)，確定刻度準(zhǔn)確。可重復(fù)使用的聚苯乙烯有機(jī)玻璃板購買時(shí)要注意底角是否為90度，底面是否光滑，清潔，如果不清潔，清洗后可用棉簽蘸酒精把孔底擦干凈。有機(jī)玻璃血凝板的好處是可以疊放，在做大批量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)節(jié)省空間。如使用一次性凝集板，要求試驗(yàn)前檢查凝集板，剔除有漏洞、形狀不規(guī)則、板面有褶皺、有接口、板面和板孔不干凈、不光滑的凝集板。

微量移液器型號(hào)的選擇、吸嘴的安裝不當(dāng)以及取樣時(shí)吸嘴外壁是否粘有液體，都會(huì)造成移液不準(zhǔn)，最終影響試驗(yàn)結(jié)果。微量震蕩器使用時(shí)應(yīng)注意震動(dòng)不宜過大，時(shí)間不能太長，一般震動(dòng)10秒鐘即可。多塊板同時(shí)振動(dòng)時(shí)要注意壓住上板，以防液體濺出而影響結(jié)果。

圖1　所需材料及儀器

二、緩沖體系的配置

所用pH7.2、0.01 mol/L PBS緩沖液盡量現(xiàn)用現(xiàn)配，以免因PBS緩沖液配制時(shí)間過長、pH值發(fā)生變化，使檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。一般情況下PBS配好后不需調(diào)節(jié)PH值，配好后高壓滅菌，冷藏保存?zhèn)溆谩Ｈ粜枰{(diào)則用1N 的NaOH調(diào)pH到7.2。PBS一經(jīng)使用，于2℃～8℃保存不超過3周。如果用滅菌生理鹽水代替PBS緩沖液，要求使用前檢查生理鹽水有無沉淀、異物，并要求將生理鹽水pH調(diào)制到7.2。

三、雞紅細(xì)胞的采取和1％懸液的配置

由于不同個(gè)體雞只紅細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性不同從而影響HI效價(jià)，所以一般需要采取3只以上公雞紅細(xì)胞混合一起用，最好用非免疫公雞，如果用免疫公雞代替，須增加洗滌次數(shù)和時(shí)間。為了保證紅細(xì)胞的穩(wěn)定性，在紅細(xì)胞懸液的制備過程中需掌握好離心速度與時(shí)間。紅細(xì)胞采集應(yīng)注意防止污染, 洗滌時(shí)要盡量抽凈白細(xì)胞膜,配制的紅細(xì)胞濃度要準(zhǔn)確。進(jìn)行紅細(xì)胞懸液配制吸取沉淀的紅細(xì)胞時(shí)，要在試管最底部吸取進(jìn)行稀釋配制，如隨意從沉淀的紅細(xì)胞上層吸取將會(huì)導(dǎo)致配制的紅細(xì)胞懸液濃度偏低，因?yàn)樽詈笠淮坞x心洗滌紅細(xì)胞后棄去的PBS液會(huì)有一些殘留在沉淀的紅細(xì)胞上層。配制過程應(yīng)該加快速度，避免室溫操作過長影響紅細(xì)胞質(zhì)量。

配好的紅細(xì)胞懸液4℃保存?zhèn)溆茫话隳鼙４?周，所以每次要根據(jù)實(shí)際需要來酌情配制，避免不必要的浪費(fèi)，切忌使用已出現(xiàn)溶血的紅細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。紅細(xì)胞懸液要用多少取多少, 使用前一定要搖勻, 保證每一孔中加入的濃度準(zhǔn)確一致。

四、四單位抗原的制備

四單位抗原是血凝試驗(yàn)很重要的關(guān)鍵因素，4單位抗原和1 ％紅細(xì)胞會(huì)因自身效價(jià)降低和溶血而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，每次實(shí)驗(yàn)前要根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量計(jì)算一下本次實(shí)驗(yàn)需要多少的4單位抗原和1 ％紅細(xì)胞，適當(dāng)配置，避免因多配而引起浪費(fèi)。試驗(yàn)所用抗原應(yīng)是穩(wěn)定性好、效價(jià)高的濃縮抗原?？乖谑褂们靶枳餮?HA)試驗(yàn)，根據(jù)該抗原的血凝價(jià)配制4HAU抗原。每次HI試驗(yàn)所用4HAU抗原均要現(xiàn)配現(xiàn)用，配好后還應(yīng)作4HAU抗原校對(duì)試驗(yàn)，以確定抗原配制是否準(zhǔn)確。配制出準(zhǔn)確的4HAU抗原是血凝抑制試驗(yàn)成功的首要條件，既不能低也不能高，同一批樣品必須使用同一批4單位，同一批紅細(xì)胞，決不能補(bǔ)充。另外，4單位抗原不要反復(fù)凍融，也不應(yīng)該存放時(shí)間太長，這樣都會(huì)影響抗原質(zhì)量。

檢驗(yàn)4單位血凝價(jià)是否準(zhǔn)確，應(yīng)將配制好的抗原稀釋液分別以1 ml的量加入生理鹽水1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml和6 ml中，使最終稀釋度為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6和1∶7，然后，從每個(gè)稀釋度取液體0.25 ml，加入1％雞紅細(xì)胞懸液0.25 ml，再加入生理鹽水0.25 ml，混勻。將血凝板在室溫下放置20～40 min后，如果配制的抗原液為4HA，則1∶4稀釋度為凝集終點(diǎn)；如果4HA高于4個(gè)單位，可能1∶5或1∶6為終點(diǎn)；如果較低，可能1∶2或1∶3為終點(diǎn)。應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果作適當(dāng)調(diào)整，使工作液確為4HA。如圖2 所示，C即為合適的4HA，A、B低于4個(gè)單位，而D和E高于4個(gè)單位。

五、待檢樣品

血樣采集后要及時(shí)分離血清，分離后及時(shí)測(cè)定或放置在4℃冰箱內(nèi)保存，受檢血清應(yīng)無溶血、無污染,要力求新鮮，如暫時(shí)不測(cè)定可冷凍保存。血清使用前要充分搖勻。待檢血清要避免反復(fù)凍融，最好4℃保存，3天內(nèi)完成檢測(cè)。血清樣品如果有溶血、膠凍樣現(xiàn)象等應(yīng)該棄去，動(dòng)物血清中經(jīng)常存在非特異性血凝抑制物質(zhì)，這種抑制物質(zhì)的濃度可能很高，容易造成假陽性反應(yīng)，尤其是水禽鴨、鵝的血清，一般應(yīng)該放置56℃滅活30 min，紅細(xì)胞吸附或用胰酶處理等方法解決。如要通過雞蛋來測(cè)抗體，卵黃用氯仿抽提后結(jié)果更為準(zhǔn)確，卵黃加氯仿（卵黃液∶PBS∶氯仿＝1∶1∶2）后混勻室溫放置30 min，3 000 r/min，離心5 min，取上清檢測(cè)。卵黃較血清HI 低1～2個(gè)滴度。對(duì)于樣品數(shù)量，中小型雞場(chǎng)0.1％，大型雞場(chǎng)不能少于30份，制備好的血清于4℃冷藏盡快送到實(shí)驗(yàn)室完成檢測(cè)。

A：2倍單位；B：3倍單位；C：4倍單位；D：5倍單位；E：6倍單位；F：無抗原對(duì)照。圖2　校驗(yàn)4單位抗原圖示

六、環(huán)境溫度與時(shí)間

因?yàn)槊總€(gè)試驗(yàn)室的環(huán)境溫度各不相同，對(duì)于南方北方、有空調(diào)和無空調(diào)的室溫、冬天夏天室溫等等的濕度溫度均不一樣，一般情況下，室溫和等待時(shí)間成反比關(guān)系。不能簡單的按照書上說的30min后判定，而應(yīng)該按照你的陰性和陽性對(duì)照的最佳沉淀和凝集時(shí)間來判定。因?yàn)殛幮詫?duì)照會(huì)沉淀，陽性對(duì)照會(huì)凝集，這個(gè)時(shí)間是可以隨加樣的準(zhǔn)確性和環(huán)境的溫濕度而變化的，所以紅細(xì)胞加入后判定結(jié)果的時(shí)間就是你的陰陽性對(duì)照成立的那一刻，即為試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)的時(shí)刻。

在環(huán)境溫度20℃～25℃，經(jīng)過20℃ 30分鐘即可讀出抗原效價(jià)和血清抗體滴度。當(dāng)溫度過低，如低于15℃時(shí)，出現(xiàn)結(jié)果就要慢，往往需要超過40分鐘才能出現(xiàn)清晰的結(jié)果。因此，為了在較短的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)結(jié)果，應(yīng)將試驗(yàn)中的環(huán)境溫度控制在20℃～25℃，冬、春季可放入相應(yīng)溫度的恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行反應(yīng)。試驗(yàn)過程中的環(huán)境溫度超過30℃時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)的要快。往往在15分鐘左右就可讀數(shù)。一旦時(shí)間過長，結(jié)果就會(huì)消失，使整板無凝集現(xiàn)象，給人一種誤以為效價(jià)為0，或抗體滴度為12 log2。故要求試驗(yàn)環(huán)境溫度不得超過30℃，反應(yīng)20～30分鐘及時(shí)讀數(shù)，不可長時(shí)間拖延讀數(shù)時(shí)間。另外，抗原與抗體作用時(shí)間過長或過短對(duì)結(jié)果影響較大：過短出現(xiàn)凝集不完全；過長出現(xiàn)洗脫現(xiàn)象。

七、結(jié)果的判定

判斷結(jié)果時(shí)，將微量血凝板傾斜45度，孔底沉淀的紅細(xì)胞流動(dòng)性好，呈淚滴狀流淌。不流淌均為凝集顆粒的為凝集孔，完全血凝的抗原或病毒最高稀釋倍數(shù)為凝集價(jià)；邊緣無凝集顆粒的為凝集抑制孔，紅細(xì)胞凝集被完全抑制的血清最高稀釋度為待檢樣品的凝集抑制價(jià)。

試驗(yàn)中一定要做好對(duì)照，結(jié)果的判定要嚴(yán)格按照對(duì)照孔的情況進(jìn)行，判定界限以100％凝集為標(biāo)準(zhǔn)，HA試驗(yàn)中，以100％凝集的病毒最大稀釋倍數(shù)為該病毒的血凝價(jià)；HI試驗(yàn)中，以100％抑制病毒凝集的血清最大稀釋度為該血清的抗體滴度，讀數(shù)過程中不能震蕩搖晃血凝板，以免影響結(jié)果。

總之，在進(jìn)行微量血凝和血凝抑制試驗(yàn)中，一定要細(xì)致耐心，嚴(yán)格按程序操作，排除各種干擾因素，發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)糾正處理，以免類似錯(cuò)誤再次出現(xiàn)，這樣才會(huì)獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以正確評(píng)價(jià)疫苗免疫的效果及輔助診斷病毒性疾病。