歐喜超 夏輝 李強(qiáng) 逄宇 趙冰 張治英 李俊晨 趙雁林

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·論著·

快速核酸提取環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用評(píng)價(jià)

歐喜超 夏輝 李強(qiáng) 逄宇 趙冰 張治英 李俊晨 趙雁林

目的 評(píng)估快速核酸提取環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)(PURE-LAMP)技術(shù)在肺結(jié)核臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 選取2012年4月至2013年1月在河南省新鄉(xiāng)市結(jié)核病防治所和獲嘉縣疾病預(yù)防控制中心就診的初診肺結(jié)核可疑癥狀者作為研究對(duì)象，共1378例。每例患者留取3份痰標(biāo)本，分別進(jìn)行痰涂片鏡檢、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測(cè)。以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，比較痰涂片鏡檢、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP法檢測(cè)MTB的效能；以固體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估PURE-LAMP檢測(cè)MTB的效能。結(jié)果 以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，痰涂片鏡檢、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測(cè)MTB的敏感度分別為23.40%(168/718)、58.91%(423/718)和49.44%(355/718)。PURE-LAMP檢測(cè)敏感度高于痰涂片鏡檢(χ2=185.02，P=0.000)，但低于固體培養(yǎng)試驗(yàn)(χ2=46.24，P=0.000)。以固體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，PURE-LAMP檢測(cè)MTB的敏感度和特異度分別為90.24%(333/369)和96.86%(924/954)，涂陰患者中檢測(cè)敏感度和特異度分別為82.52%(170/206)和97.06%(924/952)。結(jié)論 PURE-LAMP檢測(cè)操作簡(jiǎn)單，敏感度和特異度較高，在我國(guó)縣(區(qū))級(jí)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)具有一定的應(yīng)用前景。

分枝桿菌，結(jié)核； 核酸擴(kuò)增技術(shù)； 診斷

傳統(tǒng)的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法中，涂片顯微鏡檢查敏感度較低，雖然固體培養(yǎng)具有較高的敏感度，但是獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少需要3～8周，耗時(shí)較長(zhǎng)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)涌現(xiàn)出許多可用于MTB快速診斷及鑒定的方法[1-2]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)在等溫條件下可高效、快速、高特異地?cái)U(kuò)增靶核苷酸序列[3]。Iwamoto等[4]針對(duì)MTB的gyrB基因設(shè)計(jì)6條種屬特異性引物，將LAMP技術(shù)應(yīng)用到MTB復(fù)合群的檢測(cè)。2010年，研發(fā)者通過(guò)對(duì)MTB核酸提取和LAMP檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，研制出MTB快速核酸提取環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒(PURE-LAMP)，平均手工操作時(shí)間為40 min，接近于涂片鏡檢所需時(shí)間，通過(guò)使用封閉裝置進(jìn)行核酸提取，并且擴(kuò)增反應(yīng)和結(jié)果判讀在一個(gè)加熱裝置內(nèi)即可完成，操作方便并降低了污染發(fā)生的可能性。為探討該方法在區(qū)縣級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用的可行性，筆者選取河南省新鄉(xiāng)市和獲嘉縣作為研究現(xiàn)場(chǎng)，通過(guò)與臨床診斷結(jié)果和固體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果比較，評(píng)價(jià)PURE-LAMP方法在臨床樣本中檢測(cè)MTB的效能。

材料和方法

1. 研究對(duì)象：選取2012年4月至2013年1月在河南省新鄉(xiāng)市結(jié)核病防治所和獲嘉縣疾病預(yù)防控制中心就診的初診肺結(jié)核可疑癥狀者作為研究對(duì)象，共1378例。由接受過(guò)培訓(xùn)的臨床醫(yī)生詳細(xì)詢問(wèn)研究對(duì)象的一般信息、本次就診癥狀及病史，逐項(xiàng)確認(rèn)后填寫臨床信息表。每例患者留取3份痰標(biāo)本，分別進(jìn)行涂片鏡檢、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測(cè)。

2. 痰涂片檢查：涂片檢查遵照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[7]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序執(zhí)行。

3. 固體培養(yǎng)：簡(jiǎn)單法固體培養(yǎng)試驗(yàn)遵照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[8]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序執(zhí)行。

4. PURE-LAMP檢測(cè)：使用移液器將60 μl痰液和陰性對(duì)照加入到加熱管內(nèi)，將加熱管在PURE-LAMP反應(yīng)儀后端的加熱模塊于90 ℃加熱5 min后，取出加熱管并將其用力旋入吸附管，擰緊并充分混合。取出注射帽，將其推入吸附管，旋緊固定，此裝置即為L(zhǎng)AMP反應(yīng)純化裝置。持續(xù)擠壓純化裝置的吸附管，滴加反應(yīng)液至含有擴(kuò)增試劑的反應(yīng)管的兩個(gè)刻度線之間，所有核酸樣本和陰性對(duì)照均加入到反應(yīng)管后，使用毛細(xì)管吸取30 μl陽(yáng)性對(duì)照液到PURE-LAMP反應(yīng)管。蓋緊反應(yīng)管并倒置2 min，使干燥的PURE-LAMP試劑與反應(yīng)液充分混合。然后將反應(yīng)管放置到反應(yīng)儀前端的反應(yīng)模塊中。當(dāng)反應(yīng)模塊溫度達(dá)到(67±0.5) ℃后，按下右側(cè)反應(yīng)模塊計(jì)時(shí)開關(guān)，開始LAMP反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為40 min。反應(yīng)結(jié)束后取出反應(yīng)管，放入熒光檢測(cè)模塊，如果陽(yáng)性對(duì)照管顯示熒光而陰性對(duì)照管沒有熒光，則觀察各樣品是否有熒光顯示，有熒光顯示為陽(yáng)性，沒有熒光顯示為陰性；否則為檢測(cè)失敗，需要重復(fù)檢測(cè)。

5.菌群鑒定：培養(yǎng)陽(yáng)性菌株進(jìn)行16S～23S rDNA 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)測(cè)序分析，區(qū)分MTB和NTM。上游引物為5′-GGCCTAACCCTCGGGAGGGAG-3′，下游引物為5′-CCCGAGGCATATCGCAGCCTC-3′。測(cè)序引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用PCR直接測(cè)序法，在ABI PRISM 377DNA自動(dòng)測(cè)序儀上對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析。

6. 臨床診斷及隨訪：患者就診時(shí)，臨床醫(yī)生根據(jù)痰涂片、X線胸片和臨床檢查結(jié)果對(duì)納入患者進(jìn)行診斷(PURE-LAMP檢測(cè)作為評(píng)估技術(shù)不能用于患者診斷)，對(duì)確診肺結(jié)核患者開始抗結(jié)核治療。對(duì)PURE-LAMP陰性排除肺結(jié)核者于2個(gè)月后進(jìn)行隨訪。隨訪時(shí)除詢問(wèn)患者就診癥狀外，還要進(jìn)行胸部X線攝片復(fù)查，并收取患者痰標(biāo)本進(jìn)行涂片鏡檢。2個(gè)月末，根據(jù)初診痰涂片、固體培養(yǎng)、PURE-LAMP檢測(cè)和臨床檢查結(jié)果，將納入患者分為5類：涂陽(yáng)肺結(jié)核、涂陰培陽(yáng)肺結(jié)核、涂陰培陰臨床診斷肺結(jié)核、LAMP陽(yáng)性排除肺結(jié)核和LAMP陰性排除肺結(jié)核。涂陰培陰臨床診斷肺結(jié)核患者如果在2個(gè)月末時(shí)隨訪癥狀無(wú)明顯改善，則定義為不確定病例，不確定病例和未完成隨訪患者均排除分析。

7. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 17.50軟件，采用卡方檢驗(yàn)對(duì)不同檢測(cè)方法的檢測(cè)效能進(jìn)行比較分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 基本情況：1378例肺結(jié)核可疑患者中，男923例(67.0%)，女455例(33.0%)；20歲以下患者58例(4.2%)，20～歲 499例(36.2%)，40～歲465例(33.8%)，60歲及以上患者356例(25.8%)。

2.診斷類型及隨訪情況：在1378例肺結(jié)核可疑患者中，1例無(wú)臨床信息。1377例納入患者中，涂陽(yáng)肺結(jié)核168例，涂陰培陽(yáng)肺結(jié)核257例，涂陰培陰臨床診斷肺結(jié)核355例，LAMP陰性排除肺結(jié)核患者585例，LAMP陽(yáng)性排除肺結(jié)核患者12例。

對(duì)臨床診斷患者和LAMP陽(yáng)性排除肺結(jié)核患者于2個(gè)月后進(jìn)行隨訪。355例臨床診斷患者中，302例完成隨訪，隨訪完成率85.1%；12例LAMP陽(yáng)性排除肺結(jié)核患者中，5例完成隨訪?？傆?jì)60例患者未完成隨訪，9例為不配合，7例失去聯(lián)系，9例外出，5例住院，30例為其他原因。302例完成隨訪的臨床診斷患者中，293例被確診為臨床診斷病例，9例為不確定病例。5例LAMP陽(yáng)性排除肺結(jié)核患者隨訪后均被確診為非結(jié)核病患者，見圖1。

3. 3種方法檢測(cè)效能評(píng)價(jià)：以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)痰涂片、固體培養(yǎng)及PURE-LAMP檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)效能評(píng)價(jià)。在1377例有臨床信息患者中，排除60例未完成隨訪和9例不確定患者，共1308例患者的診斷結(jié)果可用于診斷效能評(píng)價(jià)，其中2例患者培養(yǎng)污染。痰涂片鏡檢、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測(cè)MTB的敏感度分別為23.40%(168/718)，58.91%(423/718)和49.44%(355/718)，PURE-LAMP檢測(cè)敏感度高于痰涂片鏡檢(χ2=185.02，P=0.000)，但低于固體培養(yǎng)試驗(yàn)(χ2=46.24，P=0.000)，見表1。

圖1 研究對(duì)象納入與隨訪流程圖

檢測(cè)方法臨床診斷肺結(jié)核(例)非結(jié)核病(例)敏感度(95%CI值)特異度(95%CI值)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(95%CI值)陰性預(yù)測(cè)值(95%CI值)痰涂片鏡檢法2340%(2030%～2650%)10000%(9930%～10000%)10000%(9730%～10000%)5175%(4885%～5466%) 陽(yáng)性1680 陰性550590固體培養(yǎng)法5891%(5531%～6251%)10000%(9930%～10000%)10000%(9900%～10000%)6659%(6348%～6970%) 陽(yáng)性4230 陰性295588PURE?LAMP4944%(4579%～5310%)9915%(9841%～9989%)9861%(9740%～9982%)6171%(5861%～6480%) 陽(yáng)性3555 陰性363585

注 PURE-LAMP：快速核酸提取環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)。敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

表2 以固體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)比較PURE-LAMP檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌效能

注 PURE-LAMP：快速核酸提取環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)。敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

4.固體培養(yǎng)試驗(yàn)與PURE-LAMP法檢測(cè)效能的比較：在1378例納入患者中，排除1例培養(yǎng)污染、7例測(cè)序菌群鑒定失敗、41例非結(jié)核分枝桿菌感染以及6例測(cè)序鑒定后為非結(jié)核分枝桿菌感染的患者，共1323例患者可進(jìn)行PURE-LAMP檢測(cè)效能分析，其中涂片陰性患者1158例。

在1323例納入患者中，以固體培養(yǎng)和測(cè)序菌群鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，PURE-LAMP檢測(cè)MTB敏感度和特異度分別為90.24%(333/369)和96.86%(924/954)。在1158例涂片陰性患者中，PURE-LAMP檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度分別為82.52%(170/206)和97.06%(924/952)，見表2。

討 論

本研究通過(guò)比較涂片鏡檢、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測(cè)診斷肺結(jié)核可疑癥狀者是否感染MTB，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PURE-LAMP檢測(cè)操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員通過(guò)肉眼觀察熒光濁度進(jìn)行結(jié)果判讀，簡(jiǎn)單方便且未發(fā)現(xiàn)結(jié)果無(wú)法判讀標(biāo)本。以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)[9-10]，PURE-LAMP檢測(cè)MTB的敏感度明顯高于涂片鏡檢，低于固體培養(yǎng)試驗(yàn)，同時(shí)低于之前研究報(bào)道的Xpert MTB/RIF檢測(cè)MTB的敏感度(58.82%)[10]。以固體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，PURE-LAMP檢測(cè)敏感度和特異度分別為90.24%和96.86%，尤其是在涂陰患者中敏感度達(dá)到82.52%，檢測(cè)效能高于國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究[5-6,11]。以上發(fā)現(xiàn)提示，PURE-LAMP檢測(cè)的臨床應(yīng)用價(jià)值高于傳統(tǒng)涂片鏡檢，可更好地輔助臨床醫(yī)生對(duì)初診肺結(jié)核可疑癥狀者進(jìn)行早期診斷和治療。

PURE-LAMP檢測(cè)與其他分子生物學(xué)檢測(cè)一樣都存在著一定的局限性，均不能得到活菌。由于MTB培養(yǎng)可得到活菌，因此，其在結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查中仍占有不可替代的重要位置，但經(jīng)過(guò)短期藥物治療的患者感染細(xì)菌受到損傷會(huì)導(dǎo)致其在培養(yǎng)基上難以生長(zhǎng)，同時(shí)，培養(yǎng)試驗(yàn)陽(yáng)性并不能排除NTM感染，需要繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)的菌種鑒定試驗(yàn)。目前，我國(guó)大多數(shù)縣(區(qū))級(jí)結(jié)防機(jī)構(gòu)均不具備開展菌種鑒定試驗(yàn)的能力，故培養(yǎng)試驗(yàn)在進(jìn)行初診肺結(jié)核可疑癥狀者的篩查方面也存在一定的局限性。

PURE-LAMP檢測(cè)操作簡(jiǎn)單，所有反應(yīng)只需在1個(gè)加熱裝置內(nèi)即可完成，封閉的反應(yīng)裝置降低了污染發(fā)生的可能性。研究發(fā)現(xiàn)，5例LAMP陽(yáng)性排除肺結(jié)核患者隨訪后均被確診為非結(jié)核病，提示初診PURE-LAMP檢測(cè)為假陽(yáng)性。由于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的準(zhǔn)確性對(duì)于患者的治療結(jié)果具有重要意義，特別是對(duì)于假陽(yáng)性患者的鑒別對(duì)于減少患者個(gè)體損傷十分重要。因此，在分子生物學(xué)診斷技術(shù)的推廣應(yīng)用過(guò)程中，臨床醫(yī)生在對(duì)就診患者進(jìn)行診斷時(shí)，需要綜合實(shí)驗(yàn)室、胸部X線攝片和臨床檢查結(jié)果，進(jìn)行最終診斷，避免出現(xiàn)漏診或過(guò)診。

結(jié)核病患者的臨床表現(xiàn)差別很大。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)條件的改善，因典型結(jié)核病臨床表現(xiàn)就診的患者越來(lái)越少，多數(shù)就診可疑患者痰標(biāo)本量很少，使得實(shí)驗(yàn)室和臨床醫(yī)生的診斷難度逐漸增大。PURE-LAMP檢測(cè)快速且敏感度高，可更好地輔助臨床醫(yī)生進(jìn)行診斷，同時(shí)該方法具有操作簡(jiǎn)單、所需痰標(biāo)本量少(60 μl)以及對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求低等優(yōu)點(diǎn)，適合在實(shí)驗(yàn)室工作條件較差的地區(qū)推廣使用。基于本次評(píng)估結(jié)果提出如下應(yīng)用建議：(1)由于PURE-LAMP檢測(cè)對(duì)實(shí)驗(yàn)室硬件要求并不高，推薦在縣(區(qū))級(jí)實(shí)驗(yàn)室使用PURE-LAMP檢測(cè)。但需要注意，PURE-LAMP檢測(cè)技術(shù)屬于分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，基層工作人員接觸較少，因此，對(duì)于接受完整培訓(xùn)(約1周時(shí)間)的基層人員而言，需要1個(gè)月的試運(yùn)行試驗(yàn)以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。(2)PURE-LAMP檢測(cè)在每批實(shí)驗(yàn)中需要完成陰性和陽(yáng)性對(duì)照，從成本和對(duì)技術(shù)的熟練程度考慮，建議優(yōu)先在每日痰標(biāo)本接收大于10份的實(shí)驗(yàn)室中開展。

志謝 感謝比爾及梅琳達(dá)·蓋茨基金會(huì)對(duì)本項(xiàng)目的支持。感謝美國(guó)帕斯適宜衛(wèi)生科技組織(PATH)在項(xiàng)目設(shè)計(jì)、實(shí)施和數(shù)據(jù)分析過(guò)程中的協(xié)助。感謝河南省疾病預(yù)防控制中心、新鄉(xiāng)市結(jié)核病防治所和獲嘉縣疾病預(yù)防控制中心的實(shí)驗(yàn)室和項(xiàng)目管理人員在項(xiàng)目實(shí)施過(guò)程中給予的支持和幫助！

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(本文編輯：李敬文)

Evaluation of rapid nucleic acid extraction loop-mediated isothermal amplification technology in the diagnosis of pulmonary tuberculosis

OUXi-chao,XIAHui,LIQiang,PANGYu,ZHAOBing,ZHANGZhi-ying,LIJun-chen,ZHAOYan-lin.

NationalTuberculosisReferenceLaboratory,NationalCenterforTuberculosisControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

Correspondingauthor:ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

Objective To evaluate the rapid nucleic acid extraction loop-mediated isothermal amplification technology (PURE-LAMP) in the diagnosis of pulmonary tuberculosis (TB). Methods A total of 1378 TB suspects were continuously recruited in Xinxiang tuberculosis dispensary and Huojia CDC from April 2102 to January 2013, three sputum specimens collecting from each patient were examined by smear, solid culture and PURE-LAMP. Then, compare sensitivities of smear, solid culture and PURE-LAMP based on the diagnosis and evaluate the sensitivity of PURE-LAMP according to solid culture result. Results Based on the diagnosis, the sensitivities of smear microscopy, solid culture and PURE-LAMP were 23.40% (168/718), 58.91% (423/718) and 49.44% (355/718), respectively. The sensitivity of PURE-LAMP was higher than that of smear (χ2=185.02,P=0.000), but lower than that of solid culture (χ2=46.24,P=0.000). Based on solid culture result, the sensitivity and specificity of PURE-LAMP were 90.24% (333/369) and 96.86% (924/954), respectively; while the sensitivity and specificity in smear negative patients were 82.52% (170/206) and 97.06% (924/952), respectively. Conclusion PURE-LAMP is easily operated, its sensitivity and specificity is relatively higher. It should be widely used in tuberculosis dispensary at county (district) level.

Mycobacteriumtuberculosis; Nucleic acid amplification technique; Diagnosis

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.05.014

中國(guó)衛(wèi)計(jì)委與比爾及梅琳達(dá)·蓋茨基金會(huì)結(jié)核病防治項(xiàng)目(2009-04-01)

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心 國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室(歐喜超、夏輝、李強(qiáng)、逄宇、趙冰、趙雁林)；帕斯適宜衛(wèi)生科技組織(張治英、李俊晨)

趙雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

2016-02-01)