韓秀娟 劉丹 封亮?├畛? 賈曉斌 董自波

[摘要]該文采用連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）體外誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）缺氧損傷模型，以丹酚酸組分對(duì)HUVEC缺氧損傷的保護(hù)作用為切入點(diǎn)，采用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活力，試劑盒測(cè)定細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）含量、乳酸脫氫酶（LDH）含量、一氧化氮（NO）含量及白細(xì)胞介素6 （IL6）和腫瘤壞死因子α（TNFα）的表達(dá)，探討7種丹參酚酸類(lèi)成分在丹酚酸組分對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)的HUVEC缺氧損傷模型的保護(hù)作用中發(fā)揮的作用。在組分結(jié)構(gòu)理論指導(dǎo)下，研究丹酚酸組分中主要化學(xué)成分在丹酚酸抗缺氧損傷藥效發(fā)揮過(guò)程中的貢獻(xiàn)度，結(jié)果顯示，丹酚酸B，迷迭香酸，丹酚酸A，丹參素，紫草酸5種成分在丹酚酸組分抗缺氧損傷作用中的貢獻(xiàn)度較大，對(duì)這5種成分分別進(jìn)行組合給藥，初步得到丹酚酸B，迷迭香酸，丹酚酸A，丹參素4種成分組合能夠作為丹酚酸組分的代表性成分。

[關(guān)鍵詞]丹酚酸組分；缺氧損傷；貢獻(xiàn)度

中藥是一個(gè)多成分的復(fù)雜體系，是化合物豐富的寶庫(kù)。組分結(jié)構(gòu)理論認(rèn)為，中藥物質(zhì)基礎(chǔ)是由多成分構(gòu)成的，且多種成分并不是簡(jiǎn)單的堆積，而是一個(gè)有序的整體，單體成分是最基本的單位，相似的單體成分按照一定的比例構(gòu)成了組分，不同的組分又按照一定的比例構(gòu)成了中藥的整體[1]。中藥發(fā)揮藥效強(qiáng)調(diào)整體性，各個(gè)成分對(duì)中藥整體藥效存在不同貢獻(xiàn)作用。本研究借助Na2S2O4體外誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞缺氧損傷模型[2]，研究丹酚酸組分中7種酚酸類(lèi)成分在丹酚酸組分發(fā)揮抗缺氧損傷藥效的貢獻(xiàn)度，以期為科學(xué)評(píng)價(jià)丹酚酸組分提供一些依據(jù)。

丹參為鼠尾草屬植物丹參Salviae miltiorrhiza的干燥根或根莖，具有活血調(diào)經(jīng)、祛淤止痛、涼血消癰、清心除煩等功效[3]。丹酚酸組分為丹參的水溶性酚酸成分，主要有丹酚酸A（salvianolic acid A）、咖啡酸（caffeic acid）、丹酚酸B（salvianolic acid B）、迷迭香酸（posrnarinic acid）、紫草酸（lithospermic acid）、原兒茶醛（protocatechualdehyde ）、丹參素（lactic acid）等[4]，具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化、消除自由基、保護(hù)線粒體、調(diào)節(jié)能量代謝、抗心肌缺血等生物活性，是治療心血管疾病的主要藥效物質(zhì)[56]。

本研究采用化學(xué)試劑Na2S2O4誘導(dǎo)建立HUVEC缺氧模型，借此模擬心肌缺血缺氧微環(huán)境，MTT法研究了丹酚酸組分、7種丹參酚酸成分對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)的HUVEC缺氧損傷的保護(hù)作用，以細(xì)胞存活率為指標(biāo)[7]，對(duì)其抗缺氧活性進(jìn)行客觀地量化評(píng)價(jià)，計(jì)算各成分在丹酚酸組分抗缺氧效果中所占的貢獻(xiàn)度，從而找出丹酚酸組分中抗缺氧主要的藥效物質(zhì)，以期為科學(xué)評(píng)價(jià)丹酚酸組分提供依據(jù)。

1材料

Agilent 1200 高效液相色譜儀（包括四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD二極管陣列檢測(cè)器）；METTLERAL204天平 （1/10萬(wàn)，梅特勒托利多儀器有限公司）；HH4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Electrom公司）；生物安全柜（Labconco Purifier Class Ⅱ Biosafety Cabinet）；LDZK50KB立式壓力蒸氣滅菌器（安海申安醫(yī)療器械廠）；低速大容量多管離心機(jī)（Anke TDL40B型，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品）；微量移液器（Thermo，美國(guó)）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；MilliQ純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo Electrom公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)器[XBK25（1/400 mm2）]。

丹酚酸組分（西安鴻生生物技術(shù)有限公司，批號(hào)140714）；連二亞硫酸鈉（美國(guó)Sigma公司）；丹參素鈉，迷迭香酸，紫草酸，原兒茶醛，咖啡酸，丹酚酸A，丹酚酸B對(duì)照品均購(gòu)自成都曼斯特生物制品有限公司，批號(hào)分別為14030108，14020115，14052702，14021902，14030510，14072511，14052113。

DMEM低糖不完全培養(yǎng)基（南京凱基生物發(fā)展公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，南京化學(xué)試劑有限公司）；MTT（美國(guó)Sigma公司）；白細(xì)胞介素6（IL6）含量測(cè)定試劑盒，腫瘤壞死因子α（TNFα）ELISA測(cè)定試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC） 購(gòu)自南京凱基生物發(fā)展公司。

2方法與結(jié)果

21色譜條件Hedera ODS2色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A） 15%甲酸（B），梯度程序洗脫（0～6 min，5%～13%A；6～13 min，13%～15%A；13～25 min，15%～18%A；25～34 min，18%～21%A；34～50 min，21%～25%A；50～60 min，25%～62%A）；流速10 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm；進(jìn)樣量10 μL。樣品和對(duì)照品均可實(shí)現(xiàn)基線分離，測(cè)定均無(wú)干擾（圖1）。

22對(duì)照品溶液制備及方法學(xué)考察分別精密稱(chēng)取丹參素鈉對(duì)照品091 mg，原兒茶醛對(duì)照品129 mg，咖啡酸對(duì)照品080 mg，迷迭香酸對(duì)照品090 mg，紫草酸對(duì)照品096 mg，丹酚酸B對(duì)照品166 mg，丹酚酸A對(duì)照品142 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度為9100，12900，8000，9000，9600，16600，14200 mg·L-1的對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液05，10，25，40，50，75 mL至10 mL量瓶中，用甲醇

稀釋并定容，搖勻，用045 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液，進(jìn)行HPLC測(cè)定其對(duì)應(yīng)的峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程（表1）。

精密度試驗(yàn)：精密吸取7種成分的對(duì)照品溶液進(jìn)行精密度考察。按色譜條件連續(xù)5次進(jìn)樣，計(jì)算丹參素，原兒茶醛，咖啡酸，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B，丹酚酸A峰面積的RSD分別為093%，056%，034%，065%，095%，088%，10%，表明儀器的精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱(chēng)取丹酚酸組分樣品平行制備6份供試品，連續(xù)進(jìn)樣，測(cè)定丹參素，原兒茶醛，咖啡酸，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B，丹酚酸A含量的RSD分別為11%，15%，11%，16%，13%，19%，17%，表明重復(fù)性均良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取丹酚酸組分樣品，分別在0，2，4，8，12，24 h時(shí)HPLC測(cè)定峰面積，計(jì)算各成分的含量，丹參素，原兒茶醛，咖啡酸，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B，丹酚酸A含量的RSD分別為11%，20%，15%，17%，12%，12%，17%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)各成分穩(wěn)定性較好。

加樣回收率試驗(yàn)：精密稱(chēng)取已知含量的丹酚酸組分樣品，制備成供試品溶液6份，吸取10 mL，置10 mL量瓶中，分別精密加入丹酚酸B對(duì)照品，蒸餾水定容至刻度，計(jì)算丹酚酸B的平均加樣回收率為9849%。

23統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所產(chǎn)生數(shù)據(jù)均采用SPSS 160 進(jìn)行處理，各組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，用±s表示，P<005為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

24MTT法篩選Na2S2O4的造模濃度以及藥物給藥濃度取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC，將其消化后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，均勻接種于96孔板上，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基，分別進(jìn)行篩選試驗(yàn)：①分別加入含終濃度為01，02，05，10，15，20，50，100 mmoL·L-1 Na2S2O4的不完全DMEM低糖培養(yǎng)基100 μL；②分別加入含終濃度為 1×10-3，8×10-4，5×10-4，2×10-4，1×10-4，5×10-5，1×10-5 g·mL-1丹酚酸組分的不完全DMEM低糖培養(yǎng)基100 μL，每個(gè)濃度均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5%CO2條件的培養(yǎng)箱中作用24 h后，吸棄上層培養(yǎng)基，每孔加入500 mg·L-1 MTT 100 μL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入100 μL二甲基亞砜（DMSO），37 ℃恒溫振蕩10 min，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度（A）。

細(xì)胞存活率=（A細(xì)胞給藥組-A空白給藥組）/（A細(xì)胞空白組-A空白組）×100%

根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定后繼實(shí)驗(yàn)中Na2S2O4以及藥物的給藥濃度。當(dāng)細(xì)胞存活率大于95%時(shí)可認(rèn)為藥物對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。結(jié)果表明，丹酚酸組分質(zhì)量濃度為1×10-5，5×10-5，1×10-4，2×10-4，5×10-4 g·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率均在95%以上，當(dāng)?shù)し铀峤M分質(zhì)量濃度增加至8×10-4 g·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率開(kāi)始下降（表2）。綜合分析，選用5×10-4 g·mL-1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的給藥濃度。

當(dāng)Na2S2O4濃度為01，02 mmol·L-1時(shí)，對(duì)細(xì)胞凋亡作用不明顯。隨著Na2S2O4濃度的增加，細(xì)胞損傷明顯，存活率呈明顯下降趨勢(shì)。當(dāng)Na2S2O4濃度為20 mmol·L-1時(shí)，細(xì)胞存活率為4875%，此時(shí)細(xì)胞損傷適中（圖2），故選擇20 mmol·L-1的Na2S2O4作為造模濃度。

25丹酚酸組分及7種酚酸類(lèi)成分對(duì)缺氧損傷的HUVEC存活率的影響實(shí)驗(yàn)分為10組，分別為空白對(duì)照組、模型組（Na2S2O4組）、丹酚酸組分組、丹參素組、原兒茶醛組、咖啡酸組、迷迭香酸組、紫草酸組、丹酚酸B組、丹酚酸A組，其中各單體組中成分含量相當(dāng)于丹酚酸組分中各種成分的含量。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將其消化后調(diào)整細(xì)胞密度接種于96孔板中，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，除空白對(duì)照孔外每孔均加入終濃度為2 mmol·L-1的Na2S2O4不完全培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中作用24 h后吸棄培養(yǎng)基，給藥組進(jìn)行細(xì)胞給藥，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱孵育24 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。

根據(jù)7種丹參酚酸化學(xué)成分及丹酚酸組分對(duì)缺氧損傷的HUVEC存活率的影響，計(jì)算各成分對(duì)缺氧損傷HUVEC的保護(hù)作用，以模型組及丹酚酸組分組對(duì)HUVEC的存活率為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各成分對(duì)丹酚酸組分整體抗缺氧損傷的貢獻(xiàn)度C。

C=Ix/Iw×100%（1）

Iw為丹酚酸組分對(duì)缺氧損傷HUVEC的保護(hù)作用；Ix為各化學(xué)成分（濃度相當(dāng)于丹酚酸組分中的含量濃度）對(duì)缺氧損傷HUVEC的保護(hù)作用。

I=給藥組細(xì)胞存活率-模型組細(xì)胞存活率

根據(jù)以上公式，計(jì)算丹酚酸組分中7種酚酸成分對(duì)缺氧損傷HUVEC保護(hù)作用的貢獻(xiàn)度。丹酚酸組分中各成分對(duì)缺氧損傷的HUVEC均具有一定的保護(hù)作用（圖3）。

根據(jù)7種丹酚酸類(lèi)成分對(duì)缺氧損傷的HUVEC存活率的影響，計(jì)算各樣品對(duì)缺氧損傷的HUVEC細(xì)胞的保護(hù)作用（表3）。

26丹酚酸組分不同成分組合對(duì)缺氧損傷HUVEC細(xì)胞的影響對(duì)7種丹參酚酸成分對(duì)缺氧損傷的HUVEC保護(hù)作用的貢獻(xiàn)度大小進(jìn)行排序，選擇貢獻(xiàn)度較大成分進(jìn)行組合給藥。實(shí)驗(yàn)分為8組，空白對(duì)照組、模型組（Na2S2O4組）、丹酚酸組分組、丹酚酸B組、丹酚酸B+迷迭香酸組、丹酚酸B+迷迭香酸+

丹酚酸A組、丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹參素組、丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹參素+紫草酸組，其中各單體組合組中成分含量相當(dāng)于丹酚酸組分中各種成分的含量。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將其消化后接種于6孔板中，種板及給藥步驟同24項(xiàng)。細(xì)胞給藥后于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下15 000 r·min-1離心3 min，收集上清，進(jìn)行試劑盒相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

正常機(jī)體內(nèi)存在一定活性的抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）等構(gòu)成的天然抗氧化系統(tǒng)，SOD是清除過(guò)量氧自由基系統(tǒng)中的抗氧化酶之一，其活性能夠反映機(jī)體抗氧化能力。丙二醛（MDA）是機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，間接反映機(jī)體組織自由基含量[8]。乳酸脫氫酶（LDH）是胞內(nèi)酶，其漏出量的多少可反映細(xì)胞膜的受損程度[9]。一氧化氮（NO）可促進(jìn)血管舒張，減少血栓的形成，但高濃度的NO 則會(huì)誘發(fā)細(xì)胞毒性，增加血管通透性，進(jìn)而導(dǎo)致血管壁損害[10]。結(jié)果顯示，經(jīng)Na2S2O4刺激后的細(xì)胞，模型組SOD的活性顯著降低（P<001），MDA，LDH和NO顯著升高，與空白對(duì)照組相比，均具有顯著差異（P<001）。與模型組相比，經(jīng)藥物處理后，各給藥組均能降低LDH，MDA，NO含量，同時(shí)提高SOD的活性，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005或P<001），表明丹酚酸組分及其各成分組合可抑制Na2S2O4誘導(dǎo)的細(xì)胞缺氧損傷，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。與丹酚酸組分相比，丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹參素+紫草酸組和丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹參素組改善SOD，MDA，LDH和NO釋放作用，無(wú)顯著差異（表4）。

白細(xì)胞介素6 （IL6）是機(jī)體免疫、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的主要分子，與炎癥調(diào)節(jié)和免疫反應(yīng)有關(guān)。腫瘤壞死因子α（TNFα）是由被激活的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌的一種可溶性多肽類(lèi)細(xì)胞因子。TNFα可刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生血小板激活因子，還對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生直接細(xì)胞毒副作用，破壞其結(jié)構(gòu)和功能的完整性，促進(jìn)炎性介質(zhì)分泌，參與血管平滑肌細(xì)胞的增殖、分化和調(diào)控，使血管壁增厚，管腔狹窄[11]。結(jié)果顯示，與空白組對(duì)比，細(xì)胞經(jīng)缺氧造模后，炎癥因子TNFα， IL6的表達(dá)顯著增高（P<001）；與模型組相比，經(jīng)藥物處理后，各給藥組均能降低TNFα， IL6的表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005或P<001），表明丹酚酸組分及其各成分組合均對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用；與丹酚酸組分相比，丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹參素+紫草酸組和丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹參素組改善TNFα，IL6的表達(dá)，無(wú)顯著差異（表5）。

3討論

中藥組分中成分較為復(fù)雜，不同成分之間的含量和生物活性存在著明顯的差異。在進(jìn)行中藥組分的評(píng)價(jià)研究時(shí)不可能兼顧到每個(gè)化學(xué)成分，但也不能盲目地挑選某個(gè)指標(biāo)成分代表組分整體[12]。因此，如何科學(xué)、合理的從組分的眾多成分中篩選出具有代表性且貢獻(xiàn)度較大的成分，使其整體性質(zhì)能夠體現(xiàn)組分的特性，進(jìn)而體現(xiàn)中藥（復(fù)方）的整體特性，是現(xiàn)代中藥研究的重點(diǎn)[1314]。本研究在考慮組分內(nèi)各成分含量和生物活性的前提下，對(duì)組分內(nèi)有限個(gè)成分進(jìn)行配伍配比后，選擇藥理作用與組分整體的藥理作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的成分組合，那么這些成分的綜合性質(zhì)就可以表征該組分整體的性質(zhì)。

丹參是治療心腦血管疾病的良藥，水溶性丹酚酸類(lèi)成分是丹參主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[15]，丹酚酸類(lèi)成分具有不同程度的抗氧自由基、抗炎和抗細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷作用。本研究針對(duì)丹酚酸組分中7種酚酸成分抗HUVEC細(xì)胞缺氧損傷作用進(jìn)行研究，借助Na2S2O4誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧損傷，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使血管內(nèi)皮功能出現(xiàn)紊亂。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能是導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素，內(nèi)皮細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)可導(dǎo)致大量活性氧的產(chǎn)生。通過(guò)MTT 實(shí)驗(yàn)篩選出最合適的造模濃度，模擬心肌缺血缺氧微環(huán)境，進(jìn)一步考察丹酚酸組分中不同成分對(duì)缺氧損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。在各成分組合給藥與組分整體的作用結(jié)果比較中，單個(gè)成分或2個(gè)成分組合的藥理作用明顯不如組分整體的藥理作用。由此可見(jiàn)，目前文獻(xiàn)和藥典中單指標(biāo)成分對(duì)組分進(jìn)行質(zhì)量控制并不科學(xué)?；谟盟幏奖恪①|(zhì)量可控原則，結(jié)合本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果貢獻(xiàn)度分析，代表丹酚酸組分整體性質(zhì)的有限個(gè)代表性成分為丹酚酸B、迷迭香酸、丹酚酸A、丹參素。這將為如何構(gòu)建丹酚酸組分生物藥劑學(xué)評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯馬超一]