王景霞 楊旭 張建軍 周恬恬 朱映黎 王林元

[摘要]探討芍藥甘草湯對中樞性肌張力增高大鼠模型的神經遞質及其受體的影響。采用線拴法所致的腦卒中恢復期痙攣性肌張力增高大鼠模型，以巴氯芬為對照，實驗組給予芍藥甘草湯3∶1配伍比例，給藥3周后測定其神經功能評分、肌張力、痛閾的變化，并采用HPLC測定大腦皮層GABA，Gly，Glu，Asp含量，免疫組化法測定大腦皮層GABA受體Aα1，B與NMDA受體亞基NR1，NR2A，NR2B蛋白表達。結果顯示芍藥甘草湯3∶1配伍劑量組對腦卒中后痙攣偏癱狀態(tài)有較好的改善作用，能顯著改善神經癥狀（P<001），降低肌張力（P<001），改善痛域（P<005）；能夠顯著增加腦內抑制性氨基酸GABA，Gly的含量（P<001），對于興奮性氨基酸Glu，Asp有降低的趨勢，但沒有統計學意義；能夠顯著增強大腦抑制性神經遞質受體GABA受體Aα1和B的表達 （P<005），并減少大腦興奮性神經遞質受體NMDA各亞型NR1，NR2A，NR2B的表達（P<005）。研究表明，芍藥甘草湯3∶1配伍劑量具有較好的解痙止痛之效，不僅能夠增加腦卒中后痙攣狀態(tài)大鼠腦內抑制性氨基酸的水平，同時還可增加其受體的表達，從而增加抑制性神經信號轉導的強度；對于腦內興奮性氨基酸水平雖然沒有顯著性作用，但也有降低的趨勢，同時對于興奮性氨基酸受體的表達也有抑制作用，從而減弱興奮性神經信號轉導的強度，減輕興奮性神經毒性。結果表明，芍藥甘草湯可通過調節(jié)腦內抑制性和興奮性神經能系統的平衡，從而達到緩解腦卒中痙攣狀態(tài)，起到柔筋止痙的作用。

[關鍵詞]芍藥甘草湯；柔筋止痙；肌張力；氨基酸；氨基酸受體

芍藥甘草湯是《傷寒論》中的名方，由芍藥和甘草2味藥組成，其配伍精當，具有酸甘化陰、養(yǎng)陰血、平肝陽、息肝風、柔筋脈、緩攣急、止疼痛的作用特點。原方雖為腳攣急所設，但后世醫(yī)家根據其配伍特點，對其拓展發(fā)揮，用于治療臨床各科肌肉痙攣疼痛，對于卒中后痙攣偏癱也取得了很好的療效[13]。本課題組前期研究成功復制了腦卒中痙攣偏癱大鼠模型，掌握了中樞性肌張力增高的變化規(guī)律，實驗結果顯示芍藥甘草湯對腦卒中后痙攣偏癱狀態(tài)有較好的改善作用，能夠顯著改善神經癥狀，降低肌張力，改善痛閾，具有解痙止痛之效，其解痙止痛最佳配伍比例為3∶1（芍藥甘草）[4]。但對于中樞性肌張力增高模型大鼠痙攣狀態(tài)的生化基礎，以及芍藥甘草湯緩解痙攣的中樞機制還不十分清楚。本實驗在前期研究的基礎上，采用線拴法所致的腦卒中恢復期痙攣性肌張力增高大鼠模型作為實驗對象，給予最佳配伍比例的芍藥甘草湯，對其柔筋止痙的作用進行進一步的確認，同時對其腦內氨基酸及其受體進行測定，分析芍藥甘草湯對痙攣偏癱大鼠的中樞神經系統的影響，探討其柔筋止痙的特色。

1材料

SD雄性大鼠120只，體重250～280 g，斯貝福（北京）實驗動物技術有限公司提供，動物許可證編號SCXK（京）20110004。

芍藥甘草湯（18∶6）原料芍藥，炙甘草購自北京圣惠堂中藥飲片公司，藥品生產許可證號分別為京20100018，京20100018。巴氯芬購自衛(wèi)達化學制藥有限公司，批號341101，規(guī)格80 mg·d-1。γ氨基丁酸（GABA），天門冬氨酸（Asp），谷氨酸（Glu），甘氨酸（Gly）購自美國Sigma公司。鄰苯二甲醛（OPA），碳酸鉀，甲醇，醋酸，乙腈，磷酸二氫鉀和硼酸購自北京國藥公司分析純試劑。γ氨基丁酸受體Aα1（GABARAα1），γ氨基丁酸受體B（GABARB），N甲基D天門冬氨酸受體1（NR1），N甲基D天門冬氨酸受體2A （NR2A），N甲基D天門冬氨酸受體2B（NR2B）等抗體購自abcam公司，貨號分別為ab52177，ab90883，ab33299，ab69873，ab84184。

MedLabU/4CS生物采集系統購自南京美易科技有限公司；新航JZ100型張力換能器購自北京新航興業(yè)科貿有限公司；高效液相色譜儀購自美國Agilent公司；JJ12J型脫水機購自武漢俊杰電子有限公司；JBP5型包埋機購自武漢俊杰電子有限公司；RM2016型病理切片機購自上海徠卡儀器有限公司；KDP型組織攤片機購自浙江省金華市科迪儀器設備有限公司；GT1001型組化筆購自Gene tech；Nikon Eclipse TiSR型倒置熒光顯微鏡，Nikon DSU3型成像系統購自日本尼康。

2方法

21動物分組及給藥

取雄性SD大鼠，隨機分為假手術組、模型組、陽性藥組、芍藥甘草湯組（芍藥甘草18∶6）。造模后除去造模失敗、死亡及無癥狀大鼠，并開始給藥，巴氯酚按135 mg·kg-1灌胃給藥，芍藥甘草湯按生藥濃度32 g·kg-1灌胃給藥（人體重按60 kg計），假手術組和模型組給等量純水，每日1次，連續(xù)給藥3周。

22造模方法

采用線拴法所致的腦卒中后痙攣性肌張力增高大鼠模型[5]，作適當改進。使用腹腔注射10%水合氯醛溶液（35 mg·kg-1）麻醉動物。大鼠采取仰臥位固定，頸部正中用手術刀切開皮膚，鈍性分離各層組織，暴露右側的頸總動脈（CCA）。分離至頸內動脈（ICA）、頸外動脈（ECA）分叉后，分離仔細避免損傷迷走神經和氣管等，置線備用。于頸總、頸內動脈處用動脈夾夾閉，頸外動脈近心端及遠心端進行結扎，中間用剪刀剪斷。將頸外動脈游離端拉至與頸內動脈成一條直線，將栓線由頸外動脈插入，插入后絲線結扎，防止出血，去除頸內動脈動脈夾，將尼龍線緩慢插入頸內動脈，繼續(xù)插入至顱內，插入深度大約（185±05） mm至微感阻力，使栓線頭端通過MCA起始處，達到較細的大腦前動脈，此時即實現右側大腦中動脈的血流阻塞，結扎ICA以固定栓線預防出血，在傷口處撒少許青霉素積極預防術后感染，用手術線逐層縫合皮膚，并留置栓線線尾端15 cm于縫合皮膚外。于術后120 min將栓線抽至頸內動脈起始部恢復腦血流，并將皮膚外的栓線剪去。手術過程中室溫保持在24～25 ℃。

23指標檢測

造模3周后對各組大鼠進行神經行為學評分、肌張力、痛閾測試等。

231神經功能缺損評分[6]參考Zea Longa標準評定：0分，無神經損傷癥狀；1分，不能完全伸展對側前爪；2分，向對側轉圈；3分，向對側傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。1～3分為模型成功，0分及4分為造模失敗。

232肌張力測定[7]將電刺激針的一端插入痙攣側后肢股四頭肌內，另一端連于電刺激器，并在后肢下端系一絲線，絲線經傳感器與四道生理記錄儀相連，定時對股四頭肌進行刺激（刺激量15 mA），通過記錄儀記錄后肢伸直的幅度，觀察大鼠肌張力情況。

233痛閾測定[8]將大鼠裝入籠內露出尾部并自然下垂，100瓦白熾燈照射刺激尾部遠端1/3處，距離為5 cm。記錄從刺激開始至大鼠出現甩尾動作的時間，連續(xù)測量3次，每次間隔5 min，取平均值作為衡量痛閾的指標。

234鄰苯二甲醛（OPA）柱前衍生HPLC熒光檢測法測定大腦皮層GABA，Gly，Glu，Asp的含量給藥結束后，各組大鼠閘刀斷頭，冰臺上快速取腦。將取得的腦組織放入標記的凍存管中，液氮凍存數分鐘后移入-80 ℃冰箱。取適量皮層組織，稱濕重，按1∶9加入生理鹽水，用手動玻璃勻漿器冰浴勻漿；勻漿液在4 ℃ 3 000 r·min-1低溫離心15 min，取上清液05 mL，加04 mol·L-1高氯酸1 mL去蛋白，同時加50 μL混合標貯備液，混合，4 ℃ 3 000 r·min-1低溫離心15 min，取上清液05 μL，加入2 mol·L-1碳酸鉀緩沖溶液1 mL，再用01 mol·L-1碳酸鉀緩沖溶液稀釋到5 mL，在4 ℃ 1萬r·min-1離心20 min，取上清液按衍生化反應和色譜條件進行洗脫。用含50%甲醇的01 mol·L-1碳酸鉀緩沖液配制成1 mmol·L-1的Asp，Glu，Gly，GABA對照品貯備液。采用美國Agilen 1100高效液相色譜儀。流動相為01 mol·L-1，pH 60磷酸二氫鉀緩沖液甲醇乙腈（6∶3∶1），用045 μm孔徑濾膜過濾，脫氣15 min。流速10 mL·min-1；熒光檢測波長為發(fā)射波長455 nm，激發(fā)波長357 nm；柱溫35 ℃；進樣量20 μL。以各氨基酸同內標的峰面積比值和各自濃度作標準曲線，測定含內標樣品的待測氨基酸與內標峰面積比值，求出樣品中4種氨基酸濃度。

235免疫組化法測定大腦皮層GABA受體Aα1，B和NMDA受體亞基NR1，NR2A，NR2B蛋白表達給藥結束后，各組大鼠腹腔注射3%水合氯醛10 mL·kg-1，麻醉大鼠，心臟穿刺經升主動脈快速灌注4 ℃生理鹽水200 mL，換用4%多聚甲醛經心臟灌流固定，斷頭取腦放入4%多聚甲醛中后固定24 h，75%乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，行石蠟包埋，制成5 μm厚度的同一冠狀面石蠟切片，用于免疫組化試驗。組織切片常規(guī)脫蠟至水，后將組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（pH 80）的修復盒中并放于微波爐內進行抗原修復。先中火8 min，后停火8 min，再轉至中低火7 min；后將切片放入3%過氧化氫溶液，在室溫避光孵育25 min，將載玻片置于PBS（pH 74）溶液中在脫色搖床上洗滌晃動3次，每次時間5 min。切片輕輕甩干后用組化筆在組織周圍畫圓圈以防止抗體流走，然后滴加3% BSA室溫封閉30 min，甩干BSA后在圈內滴加用3% BSA按一定比例稀釋好的一抗來覆蓋組織。將切片平放置于4 ℃濕盒內孵育過夜。后將載玻片置于PBS（pH 74）中在脫色搖床上洗滌晃動3次，每次時間5 min。切片稍甩干后在組織上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下嚴格控制顯色時間，陽性為棕黃色，后用自來水沖洗切片以終止顯色。然后用Harris蘇木素復染3 min左右，使用自來水進行沖洗，再用1%鹽酸乙醇分化數秒，自來水沖洗，氨水返藍，再流水反復沖洗。然后將切片依次放入70%乙醇，80%乙醇，90%乙醇，95%乙醇，無水乙醇Ⅰ，無水乙醇Ⅱ，二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ中各5 min脫水透明，后將切片從二甲苯取出稍晾干，最后中性樹膠封片。鏡下觀察細胞及軸突出現棕黃色為陽性細胞。陰性對照組用一抗稀釋液（PBS液）代替一抗，其余步驟同實驗組。顯色后封片，顯微鏡下觀察照相，每組切片20倍物鏡，10倍目鏡下隨機選取9個視野進行測量分析。采用Imagepro plus 60病理圖像分析系統分析皮層中GABAARα1，GABABR，NR1，NR2A，NR2B的積分光密度（integral optical density，IOD）。

24統計學處理

采用SPSS 200統計軟件對數據進行處理，結果以±s表示，組間均值比較采用T檢驗，各組數據采用單因素方差分析（OneWay ANOVA）進行統計學分析，兩兩比較選擇Dunnett，方差齊采用LSD檢驗，方差不齊采用Tamhanes T 2法進行多重比較，以P<005為差異有統計學意義。

3結果

31芍藥甘草湯對大鼠神經癥狀評分的影響

假手術組與模型組比較有統計學意義（P<0001），說明模型組出現明顯的神經功能障礙；巴氯酚組與模型組比較無統計學意義；芍藥甘草湯組與模型組比較有統計學意義（P<001），說明芍藥甘草湯對卒中后痙攣偏癱大鼠的神經功能障礙有顯著的改善作用（表1）。

32芍藥甘草湯對大鼠肌張力的影響

假手術組與模型組比較有統計學意義（P<0001），說明模型組大鼠的肌張力明顯增高；巴氯芬組與模型組比較有統計學意義（P<001）；芍藥甘草湯組與模型組比較有統計學意義（P<001），說明芍藥甘草湯能顯著降低卒中后痙攣偏癱大鼠的肌張力（表1）。

33芍藥甘草湯對大鼠痛域的影響

假手術組與模型組比較有統計學意義（P<005），說明模型組大鼠對疼痛耐受性降低；巴氯芬組與模型組比較無統計學意義；芍藥甘草湯組與模型組比較有統計學意義（P<001），說明芍藥甘草湯能明顯提高卒中后痙攣偏癱大鼠對疼痛的耐受，緩解痙攣期的肌肉疼痛（表1）。

34芍藥甘草湯對大鼠腦內GABA，Gly，Glu，Asp的影響

模型組大鼠腦內GABA，Gly含量明顯下降（假手術組與模型組比較均有統計學意義，P<0001），而Glu，Asp含量明顯升高（假手術組與模型組比較均有統計學意義，P<0001）；巴氯酚對GABA，Gly含量有升高的趨勢（與模型組比較均無統計學意義），能顯著降低Glu，Asp含量（與模型組比較有統計學意義，P<0001，P<001）；芍藥甘草湯能顯著升高卒中后痙攣偏癱大鼠腦內GABA，Gly含量（與模型組比較均有統計學意義，P<001），對Glu，Asp含量有降低的趨勢（與模型組比較均無統計學意義）（表2）。

35芍藥甘草湯對大鼠腦內GABARAα1，GABARB，NMDAR1，NMDAR2A，NMDAR2B蛋白表達的影響

模型組大鼠腦內GABA受體Aα1，B蛋白表達明顯減少（假手術組與模型組比較均具有極顯著統計學意義，P<0001），NMDA受體NR1，NR2A，NR2B蛋白表達明顯增加（假手術組與模型組比較均具有統計學意義，P<005或P<0001）；巴氯酚對GABA受體Aα1蛋白表達有增加趨勢（與模型組比較無統計學意義），對GABA受體B蛋白表達表

達明顯增加（與模型組比較有統計學意義，P<0001），對NMDA受體NR1，NR2A，NR2B蛋白表達有減少趨勢（與模型組比較均無統計學意義）；芍藥甘草湯能顯著增加卒中后痙攣偏癱大鼠腦內GABA受體Aα1，B蛋白表達（與模型組比較均有統計學意義，P<005），減少NMDA受體NR1，NR2A，NR2B蛋白表達（與模型組比較均有統計學意義，P<005）（表3）。

·

4討論

現代醫(yī)學認為痙攣主要可分為中樞性痙攣和周圍性痙攣[9]，而腦卒中痙攣狀態(tài)屬于中樞機制產生的肌張力增高異常變化，現代研究其與腦內的氨基酸類神經遞質失衡關系密切[1014]。氨基酸類神經遞質分為興奮性氨基酸和抑制性氨基酸，抑制性神經遞質包括γ氨基丁酸、甘氨酸等，興奮性神經遞質包括谷氨酸、天門冬氨酸、P物質等。研究表明腦內氨基酸濃度在痙攣狀態(tài)中具有重要的作用，抑制性氨基酸濃度的降低與興奮性氨基酸濃度的升高能夠影響肌張力異常增高[15]。羊繼平等[16]研究表明抑制性氨基酸上升，興奮性氨基酸下降與緩解肌肉痙攣關系密切。研究表明甘氨酸存在于小腦、海馬、延髓、脊髓中[17]，其受體具有多個亞型，甘氨酸能夠與γ氨基丁酸具有協同釋放作用機制，甘氨酸是痙攣狀態(tài)產生的重要影響因素。研究發(fā)現[1820]，Glu至少興奮N甲基D天門冬氨酸等5種受體，受體激活后引起神經元迅速又持久的興奮效應，從而引起肢體痙攣狀態(tài)；GABA可通過GABAB受體結合，抑制Ca2+流入前突觸，并抑制興奮性神經遞質從而緩解肌痙攣。同時，GABA是負責Iα傳導纖維通過脊髓中間神經元，對突觸起到抑制性作用[16]。有報道顯示[21]，局灶性腦缺血28 d后，由于抑制性中間神經元的選擇性死亡及軸索消失，缺血梗死灶部位GABA受體的2種亞型A，B介導的抑制效應分別降低了47%，37%。亦有文獻報道顯示[22]，腦缺血時，由于Glu暴發(fā)性釋放，其受體大量激活，突觸后神經元過度產生興奮、潰變，最后導致神經元的死亡，產生了神經毒性。對抗興奮性損傷的治療包括減少突觸前膜氨基酸的釋放以及抑制突觸后膜氨基酸受體的激活，而這其中對于阻斷突觸后膜NMDA受體的激活尤為重要[23]。Zepeda等[24]報道，腦缺血后產生的細胞蛋白、NMDA受體及GABA受體表達的異常改變是由于興奮性和抑制性信號系統失衡而產生的一種功能性改變。而現代解痙常用藥巴氯酚屬于GABA受體激動劑，其主要作用于突觸前GABAB受體，能夠抑制興奮性氨基酸受體的釋放，緩解神經細胞興奮性，從而緩解痙攣，有學者研究發(fā)現[25]腦缺血5 min后給予GABA受體激動劑巴氯酚具有神經保護作用，但對于巴氯酚的其他作用機制還未明確。

中醫(yī)學認為中樞性肌張力增高的基本病機主要為陰陽失調，氣血逆亂，其病理多屬于本虛標實。氣血衰少，肝腎陰虛為其致病之本，風、火、痰、氣、瘀為其發(fā)病之標，兩者可互為因果。人體的陰陽處于不斷消長平衡的狀態(tài)，如果某一方出現偏盛或偏衰就成了一種病理狀態(tài)。正常情況下，剛柔相濟，陽剛陰柔，內外陰陽平衡，則人體處于健康狀態(tài)，肢體運動功能正常。在卒中狀態(tài)下，人體肝腎陰津匱乏，則肝陽上亢，風中于腦，則發(fā)為中風，陰精虧虛，肢體筋脈得不到濡養(yǎng)，則筋脈攣急，產生痙攣狀態(tài)。所以對卒中后痙攣狀態(tài)的治療，當以平調陰陽為本。芍藥甘草湯作為解痙止痛的經典方劑，可酸甘化陰，使筋脈得到陰津濡潤，則攣急諸證皆平。但是其作用機制研究還不夠深入，現代研究多為芍藥與甘草的單體成分，李冬梅等[26]研究發(fā)現芍藥苷能夠明顯降低腦缺血再灌注沙土鼠腦內興奮性氨基酸水平，王景霞等[27]研究發(fā)現芍藥苷能夠顯著降低抑郁癥大鼠腦內谷氨酸的含量，對于芍藥甘草配伍對腦損傷的保護作用及其解痙機制還未明確。本實驗結果再次驗證了芍藥甘草湯緩解中樞性痙攣、降低肌張力的療效，同時腦內氨基酸含量及其受體表達測定結果表明，芍藥甘草湯能夠顯著性升高模型大鼠腦內抑制性氨基酸GABA，Gly的含量水平，對于興奮性氨基酸Glu，Asp的含量有降低趨勢，能顯著增加GABA受體Aα1，B蛋白表達，減少NMDA受體NR1，NR2A，NR2B蛋白表達。

本實驗研究表明，腦卒中大鼠腦內不同氨基酸含量以及相應受體的異常表達可能是導致痙攣狀態(tài)的重要因素。芍藥甘草湯既能增加抑制性氨基酸GABA，Gly的含量，又能激活GABA受體Aα1和B，促進γ氨基丁酸與其受體的結合，使得GABA神經信號傳導加強，抑制性神經信號占主導地位；同時芍藥甘草湯雖然對興奮性氨基酸Glu，Asp的含量沒有明顯影響，但卻可以抑制谷氨酸的離子型受體NMDAR1，NMDAR2A，NMDAR2B的表達，減少谷氨酸與其受體的結合，從而抑制Glu神經信號的傳導，興奮性神經信號受到抑制。按照中醫(yī)對物質陰陽屬性的劃分，大腦中樞抑制性神經遞質屬“陰”，而興奮性神經遞質屬“陽”。正常情況下興奮性神經遞質和抑制性神經遞質處于一個動態(tài)平衡中，即“陰平陽秘”。腦卒中后由于中樞神經受損引致抑制性神經遞質不能制約興奮性神經遞質，即“陰不制陽”，從而導致興奮性神經遞質的過度釋放，即“陽亢無制”，引起骨骼肌的張力增高，呈痙攣狀態(tài)。芍藥甘草配伍可通過“酸甘化陰”功能，滋陰制陽，即調節(jié)大腦中樞抑制性和興奮性神經遞質系統，達到“柔筋止痙”的作用，即緩解腦卒中后的肢體痙攣狀態(tài)。綜合來看，芍藥甘草湯可以調節(jié)抑制性和興奮性能神經的平衡，但以增強抑制性神經通路為主，這與巴氯酚對GABABR的單向激活作用是不同的，可能與芍藥甘草湯成分復雜，具有多項調節(jié)功能有關。

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[責任編輯馬超一]