周良云 呂朝耕 康傳志 王升 唐金富 康利平 郭蘭萍

[摘要]為了考察黃花蒿在重金屬鎘脅迫下，是否存在相應(yīng)的促分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）基因參與鎘信號(hào)的傳導(dǎo)。該文通過(guò)對(duì)SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中的黃花蒿轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行拼接組裝、BLAST以及對(duì)所得序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，最終獲得17條黃花蒿MAPK基因，命名為AaMAPK1～AaMAPK17。在這17個(gè)MAPK基因中，有16個(gè)含有T[D/E]Y保守結(jié)構(gòu)域。實(shí)驗(yàn)利用Realtime PCR方法，分析了黃花蒿在重金屬鎘脅迫下17個(gè)MAPK基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示AaMAPK3，AaMAPK10的表達(dá)下調(diào)，MAPK7，MAPK9，MAPK12的表達(dá)上調(diào)。這表明了黃花蒿中可能存在相應(yīng)的MAPK基因參與了鎘信號(hào)傳導(dǎo)。

[關(guān)鍵詞]黃花蒿；MAPK基因；鎘脅迫；表達(dá)分析

促分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）是絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶的一個(gè)大家族，廣泛存在于真核生物中。MAPK級(jí)聯(lián)途徑包括3種蛋白激酶：MAPKKK，MAPKK，MAPK[1]。植物在響應(yīng)外界的生物和非生物脅迫時(shí)，可以通過(guò)該級(jí)聯(lián)途徑將上游信號(hào)和下游的應(yīng)答分子聯(lián)系起來(lái)[2]。MAPKKK是位于級(jí)聯(lián)途徑上游的組件，通過(guò)信號(hào)分子的受體或其本身直接感受胞外刺激而被磷酸化激活。激活后的MAPKKK通過(guò)磷酸化MAPKK保守基序S/TX35S/T中的絲氨酸或絲氨酸/蘇氨酸殘基以激活MAPKK。MAPK是位于級(jí)聯(lián)途徑下游的組件，它含有一個(gè)非常保守的TXY（目前只發(fā)現(xiàn)TDY，TEY 2種）基序。MAPK的激活需要上游的MAPKK對(duì)它雙重磷酸化，磷酸化位點(diǎn)是TXY基序中的酪氨酸和蘇氨酸殘基[2]。被激活的MAPK進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，再通過(guò)激活特定轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)功能基因的表達(dá)，或停留在細(xì)胞質(zhì)中激活其它蛋白激酶，最終引起植物細(xì)胞響應(yīng)內(nèi)外刺激產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng)[3]。隨著人們對(duì)植物體MAPKs作用研究的深入，越來(lái)越多的數(shù)據(jù)顯示MAPKs在植物信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起著重要的作用。許多植物體內(nèi)的MAPKs可以被生物因子（如微生物病原體感染）和非生物因子（如重金屬、干旱、高鹽、寒冷、過(guò)高或過(guò)低的滲透壓）所激活[12]。

黃花蒿Artemisia annua L為菊科一年生植物，其地上部分即為我國(guó)傳統(tǒng)中藥青蒿，具有清虛熱、涼血、截瘧等功效[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃花蒿的抗瘧活性成分為青蒿素。雖然青蒿素已可以人工合成，但由于成本高、毒性大而未能投產(chǎn)。目前，通過(guò)人工栽培從原植物黃花蒿中提取分離依然是青蒿素的主要商業(yè)來(lái)源。本實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示[56]，在不同濃度重金屬鎘脅迫黃花蒿的土壤栽培以及水溶液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中均能觀察到一定濃度的重金屬鎘顯著提高了青蒿素的合成與積累。然而，關(guān)于黃花蒿通過(guò)什么途徑將外界鎘信號(hào)傳遞到胞內(nèi)進(jìn)而引起其次生代謝產(chǎn)物的合成發(fā)生變化依然未有相關(guān)報(bào)道。Liu等 [7]發(fā)現(xiàn)，擬南芥在鎘脅迫下，MAPK3和MAPK6的基因被激活。然后當(dāng)預(yù)先使用活性氧清除劑時(shí)，可有效地抑制MAPK3和MAPK6的活性。該結(jié)果表明，擬南芥在重金屬鎘脅迫下信號(hào)傳導(dǎo)通路是鎘ROSMAPK3/MAPK6。另外，在鎘脅迫紫花苜蓿的研究中同樣發(fā)現(xiàn)了MAPK級(jí)聯(lián)途徑參與鎘信號(hào)的傳導(dǎo)，其傳導(dǎo)通路為鎘SIMK/SAMK/MMK2/MMK3[8]。為了考察黃花蒿在重金屬鎘脅迫下，是否存在相應(yīng)的MAPK基因參與鎘信號(hào)的傳導(dǎo)。本研究通過(guò)在水培液中添加不同濃度鎘的方法脅迫處理黃花蒿，并于處理后不同時(shí)間收集葉片組織，對(duì)其MAPK基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，鑒定可能參與鎘信號(hào)傳導(dǎo)的MAPK基因。

1材料

實(shí)驗(yàn)所用黃花蒿A annua種子來(lái)源于西南瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室桂蒿3號(hào)種子。播種前，將蛭石滅菌，分裝于花盆中，每個(gè)花盆裝蛭石至三分之二高度處，黃花蒿生長(zhǎng)期間，每3 d澆1次營(yíng)養(yǎng)液，每天澆1次蒸餾水，保持蛭石一定的含水量，待生長(zhǎng)至5 cm左右高度，隨機(jī)選取黃花蒿幼苗置于含1 L pH 58 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的水培罐中培養(yǎng)，每罐3株，用洗凈滅菌的海綿包住苗莖固定，2 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。培養(yǎng)條件：溫度 25 ℃；鈉燈為光源，每天光照12 h。

水溶液培養(yǎng)黃花蒿40 d后，以Cd（NO3）2·4H2O的形式添加到營(yíng)養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)設(shè)定2個(gè)處理組：分別為20，80 μmol·L-1。以0 μmol·L-1為對(duì)照組，以1罐為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理設(shè)6個(gè)重復(fù)。取樣時(shí)間設(shè)定為0，4，8，12，24，48，60，72 h。樣品用液氮速凍后，置于-80 ℃保存。

2方法

21數(shù)據(jù)下載NCBI的SRA（The Sequence Read Archive）數(shù)據(jù)庫(kù)中存儲(chǔ)了大量由二代測(cè)序平臺(tái)包括Roche 454 GS System，Illumina Genome Analyzer，Applied Biosystems SOLiD System等測(cè)得的原始序列。SRA數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了黃花蒿的成熟葉片腺毛、幼葉腺毛、子葉、分生組織以及花蕾腺毛5個(gè)組織的轉(zhuǎn)錄組序列，這5個(gè)轉(zhuǎn)錄組序列均由Roche 454 GS FLX平臺(tái)測(cè)得。

22數(shù)據(jù)組裝用SRA Toolkit （http：//eutilsncbinihgov/Traces/sra/？view=software）將從NCBI下載的SRA文件轉(zhuǎn)成SFF格式文件，然后用454 Data Analysis Software package （http：//www454com/products/analysissoftware/）中的sffinfo （s參數(shù)）提取SFF文件中的序列信息得到FASTA格式的序列文件。用轉(zhuǎn)錄組拼接軟件Trinity （http：//trinityrnaseqsourceforgenet）把5個(gè)庫(kù)的FASTA序列文件進(jìn)行拼接，使用參數(shù)seqType fa single CPU 8，從而把測(cè)序數(shù)據(jù)拼接成轉(zhuǎn)錄本序列。在拼接結(jié)果中，選最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本序列作為該基因的代表轉(zhuǎn)錄本（Unigene）。

23AaMAPK家族基因的獲取以擬南芥的MAPKs為query序列，1×10-6作為E Value的臨界值，進(jìn)行本地BLAST，所得序列進(jìn)行保守域和Pfam分析，以獲取黃花蒿的MAPKs基因。

24引物設(shè)計(jì)從Unigene中調(diào)出AaMAPKs基因序列，根據(jù)Realtime PCR引物設(shè)計(jì)需滿(mǎn)足的條件通過(guò)Primer Premier 50軟件設(shè)計(jì)特異性引物，并交由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

25總RNA的提取與實(shí)時(shí)熒光定量分析從-80 ℃冰箱取出試驗(yàn)材料，在EP管中加入磁珠，用球磨粉碎機(jī)粉碎?？俁NA的提取參照QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit （cat nos 74903 and 74904）和RNaseFree DNase Set（cat no79254）說(shuō)明操作。使用Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimerScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，生成單鏈cDNA。冰上配置反應(yīng)體系為10 μL，包含5 μL Power SYBR Green PCR Master Mix （Applied Biosystems，USA），1 μL cDNA，1 μL primers （上下游引物已混合，各引物的量約為25 mmol·L-1），ddH2O 3 μL，在ABI 7500定量分析儀上進(jìn)行反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件為：酶活化（50 ℃，2 min）；預(yù)變性（95 ℃，10 min）；變性（95 ℃ 15 s），退火和延伸（60 ℃ 1 min）40個(gè)循環(huán)。最后添加溶解曲線設(shè)置。相對(duì)定量分析結(jié)果采用2-ΔΔCT法計(jì)算[9]。

26數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪圖。

3結(jié)果

31數(shù)據(jù)組裝對(duì)SRA庫(kù)中的數(shù)據(jù)組裝，組裝結(jié)果共獲得25 168條Contigs，其中長(zhǎng)度大于1 000 bp的Contig共有3 292條，長(zhǎng)度大于500 bp的Contig共有12 743條。組裝后的Contig平均長(zhǎng)度為627 bp，最長(zhǎng)Contig為5 709 bp，其中N50為691 bp，N90為357 bp。

32AaMAPKs基因及其引物特異性檢測(cè)通過(guò)Blast和結(jié)構(gòu)域的分析，在黃花蒿Unigene數(shù)據(jù)中得到17條序列，其中有10個(gè)TEY類(lèi)型的MAPKs基因，6個(gè)TDY類(lèi)型的MAPKs基因，1個(gè)未知類(lèi)型。根據(jù)搜索到的MAPKs基因序列設(shè)計(jì)并合成相關(guān)基因的特異性引物，結(jié)果見(jiàn)表1。各MAPKs基因命名先分TEY和TDY 2大類(lèi)，再按得到的序列長(zhǎng)短依次命名。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所有引物的PCR產(chǎn)物熔解曲線均是單峰，表明引物特異性好。各引物的熔鏈溫度（Tm）分別為：MAPK1 7908；MAPK2 7575；MAPK3 7723；MAPK4 763；MAPK5 7463；MAPK6 7445；MAPK7 7556；MAPK8 7815；MAPK9 7297；MAPK10 7519；MAPK11 7815；MAPK12 789；MAPK13 7878；MAPK14 7518；MAPK16 776；MAPK17 7815。

33AaMAPKs基因表達(dá)差異分析在黃花蒿Unigene中共搜索到17個(gè)MAPK基因，其中MAPK15在黃花蒿葉片中表達(dá)量較低，因此在本試驗(yàn)中沒(méi)有檢測(cè)其相對(duì)表達(dá)量。16個(gè)AaMAPKs基因相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖1。由圖可見(jiàn)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，AaMAPK3，AaMAPK10 2個(gè)基因在對(duì)照組中的表達(dá)量始終高于20，80 μmol·L-1處理組，說(shuō)明了黃花蒿在鎘的誘導(dǎo)下AaMAPK3，AaMAPK10基因的表達(dá)水平受到了抑制。AaMAPK3，AaMAPK10均屬于TEY類(lèi)型基因。AaMAPK7，AaMAPK9，AaMAPK12在20，80 μmol·L-1處理組中的表達(dá)量均高于對(duì)照組且處理濃度越高表達(dá)量越高，說(shuō)明鎘對(duì)黃花蒿中AaMAPK7，AaMAPK9，AaMAPK12的表達(dá)表現(xiàn)出促進(jìn)作用。其中AaMAPK7，AaMAPK9屬于TEY類(lèi)型，AaMAPK12屬于TDY類(lèi)型。隨著處理時(shí)間的變化，AaMAPK6基因在對(duì)照組和各處理組中表達(dá)趨勢(shì)基本一致，且相對(duì)于0 h表達(dá)量均較高?？紤]到在取樣過(guò)程中要剪取葉片，對(duì)植株造成了損傷，因此推測(cè)AaMAPK6基因的表達(dá)可能與機(jī)械損傷有關(guān)，說(shuō)明機(jī)械損傷在一定程度上能夠促進(jìn)AaMAPK6的表達(dá)。通過(guò)結(jié)構(gòu)域的分析AaMAPK6基因?qū)儆赥EY類(lèi)型。

4討論

將黃花蒿SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中5個(gè)EST庫(kù)進(jìn)行組裝得到了質(zhì)量較高的黃花蒿Unigene，為搜索黃花蒿的AaMAPKs基因提供可靠的檢索數(shù)據(jù)庫(kù)。目前，已有許多植物MAPK基因被分離出來(lái)，其中擬南芥有20個(gè)[10]，水稻有17個(gè)[11]，玉米有19個(gè)[12]，煙草17個(gè)[13]，番茄16個(gè)[14]。本研究通過(guò)Blast和結(jié)構(gòu)域的分析，在黃花蒿Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到了17條序列。其中有10個(gè)TEY類(lèi)型的MAPKs基因，6個(gè)TDY類(lèi)型的MAPKs基因，1個(gè)未知類(lèi)型。而在模式植物擬南芥中的20個(gè)MAPKs基因中，12個(gè)屬于TEY類(lèi)型，8個(gè)屬于TDY類(lèi)型[15]。這說(shuō)明不同物種之間MAPK基因的數(shù)目和結(jié)構(gòu)域分類(lèi)不同，這些基因可能參與植物不同的生理活動(dòng)。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)鎘誘導(dǎo)下黃花蒿中MAPK基因的表達(dá)進(jìn)行差異性分析，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)MAPK基因（AaMAPK3和AaMAPK10）的表達(dá)量下調(diào)，3個(gè)MAPK基因（MAPK7，MAPK9，MAPK12）的表達(dá)量上調(diào)，這說(shuō)明了黃花蒿中存在相應(yīng)的MAPK基因參與了鎘信號(hào)的傳導(dǎo)作用。有趣的是，本研究中發(fā)現(xiàn)AaMAPK3，AaMAPK10 2個(gè)基因在重金屬鎘作用下表達(dá)量下降。然而到目前為止有關(guān)植物在重金屬鎘及其他外源物作用下，MAPK基因表達(dá)下調(diào)鮮有報(bào)道[16]。同時(shí)，表達(dá)下調(diào)的MAPK基因在植物信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中承擔(dān)著何種作用仍然未知。另外，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析推測(cè)黃花蒿中存在一個(gè)MAPK基因?qū)C(jī)械損傷有響應(yīng)作用，并且在損傷下該基因的表達(dá)量升高。

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[責(zé)任編輯呂冬梅]