林庭庭 王冬 戴住波 張學(xué)禮 黃璐琦

[摘要]羽扇豆醇、樺木酸等羽扇豆型三萜化合物具有抗HIV、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性，其中羽扇豆醇為這類化合物的基本前體。為了實(shí)現(xiàn)羽扇豆烷型三萜的異源發(fā)酵法生產(chǎn)，研究首先運(yùn)用高通量同源重組法在釀酒酵母中進(jìn)行萜類甲羥戊酸（MVA）途徑的一步法調(diào)控，以提高三萜通用前體鯊烯的供給；在進(jìn)一步工作中，擬南芥來(lái)源的羽扇豆醇合成酶基因（AtLUP）被整入三萜底盤菌株中實(shí)現(xiàn)羽扇豆醇酵母人工細(xì)胞工廠的創(chuàng)建。結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)?zāi)芤淮瓮瓿蒑VA途徑的7個(gè)基因的整合，組裝總長(zhǎng)度達(dá)到20kb，同時(shí)多倍化MVA途徑能顯著提高鯊烯產(chǎn)量約500倍，達(dá)到35400 mg·L-1；AtLUP基因在染色體上整合后獲得的工程菌NK2LUP在搖瓶中發(fā)酵能生產(chǎn)823 mg·L-1羽扇豆醇。該研究可為在酵母中實(shí)施大規(guī)模生物合成途徑組裝提供技術(shù)支持，同時(shí)為進(jìn)一步獲高產(chǎn)羽扇豆烷型三萜的人工酵母細(xì)胞提供了重要基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]三萜；羽扇豆醇；合成生物學(xué)；釀酒酵母

羽扇豆烷型（lupanetype）三萜是一類藥用植物中微量合成的五環(huán)三萜類次生代謝物，主要包括羽扇豆醇（lupeol）、樺木酸（betulinic acid）和相應(yīng)的衍生物[1]。其中，羽扇豆醇是這類化合物生物合成的基本前體物質(zhì)。在植物細(xì)胞中，它可以在P450氧化酶的催化作用下發(fā)生C28位氧化，依次轉(zhuǎn)化成樺木醇、樺木醛并最終氧化成樺木酸[24]。1995年P(guān)isha等[5]發(fā)現(xiàn)了樺木酸具有較高選擇性的抗黑色素瘤活性后，其出色的抗HIV活性也被人們發(fā)現(xiàn)[67]。目前，樺木酸和樺木酸衍生物Bevirimat已作為抗黑色素瘤藥物或抗HIV的候選藥物進(jìn)入臨床研究階段[8]，然而，樺木酸在樺木中的含量只有0025%[9]，新的資源途徑迫切需要解決。

釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae是一種生物安全的模式真核生物，其遺傳背景清晰，遺傳改造策略及發(fā)酵方法成熟，已被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建生產(chǎn)青蒿素[10]，人參皂苷[1112]，番茄紅素[13]和β胡蘿卜素[14]等天然萜類活性物質(zhì)的底盤工程菌株。異戊烯焦磷酸（IPP，isopentenyl pyrophosphate）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP，dimethylallyl pyrophosphate）為萜類生物合成的基本單元，自然界可經(jīng)乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶、羥甲基戊二酰輔酶A合酶、3羥基3甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶和異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶等7個(gè)酶組成的甲羥戊酸途徑（MVA pathway）合成。IPP和DMAPP可依次在法呢基焦磷酸合成酶和鯊烯合酶的催化作用下合成三萜通用前體鯊烯（squalene）。在釀酒酵母中，鯊烯可以繼續(xù)被鯊烯環(huán)氧酶氧化為環(huán)氧鯊烯（2，3oxidosqualene），繼而可以被羊毛甾醇環(huán)合酶等酶催化生成羊毛甾醇（lanosterol）和麥角固醇（ergosterol）等物質(zhì)。在其他物種中，環(huán)氧鯊烯也可以被不同類型的環(huán)氧鯊烯環(huán)化酶催化生成各種類型的三萜母核，如β香樹(shù)脂，葫蘆二烯醇和羽扇豆醇等[1]，見(jiàn)圖1。其中，羽扇豆醇能被樺木酸合成酶催化生成樺木酸[24]。

在本研究中，首先運(yùn)用高通量同源重組法在釀酒酵母CENPK21D中進(jìn)行萜類甲羥戊酸（MVA）全途徑基因的一步法整合調(diào)控，實(shí)現(xiàn)多基因、超長(zhǎng)度、高精度的基因組定點(diǎn)整合，獲得鯊烯（三萜通用前體）含量顯著提高的底盤菌；在此基礎(chǔ)上，通過(guò)整合擬南芥Arabidopsis thaliana來(lái)源的羽扇豆醇合成

酶基因（AtLUP），構(gòu)建出羽扇豆醇的生物合成途徑，為構(gòu)建高產(chǎn)羽扇豆烷型三萜釀酒酵母細(xì)胞工廠提供基礎(chǔ)，同時(shí)為酵母中實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生物合成途徑精確組裝提供技術(shù)支持。

1材料

11工具酶與試劑PrimeSTAR HS DNA聚合酶購(gòu)自于大連寶生物工程公司；酵母基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；氨芐青霉素、DNA清潔試劑盒與DNA回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母選擇培養(yǎng)基購(gòu)自北京泛基諾科技有限公司；羊毛甾醇、麥角固醇、鯊烯和羽扇豆醇對(duì)照品購(gòu)自美國(guó)SigmaAldrich公司；其他試劑均為分析純。

12質(zhì)粒，菌株及引物本次研究所用的質(zhì)粒，菌株及引物信息見(jiàn)表1，2。

13培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：1%蛋白胨，05%酵母粉，1%氯化鈉，100 mg·L-1氨芐青霉素；SM[Ura]篩選培養(yǎng)基：08%酵母選擇培養(yǎng)基（三缺，UraTrpHis），2%葡萄糖，001%Trp，001%His；SM[UraTrp]篩選培養(yǎng)基：08%酵母選擇培養(yǎng)基（三缺，UraTrpHis），2%葡萄糖，001%His；YPD培養(yǎng)基：2%蛋白胨，1%酵母粉，2%葡萄糖。上述液體培養(yǎng)基加2%的Agar可配成相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。

2方法

21NK2SQ系列菌株的構(gòu)建構(gòu)建NK2SQ系列工程菌株所采用的方法為多片段同源重組，見(jiàn)圖2，表3。首先，Group A中模板和引物的搭配方案，用PrimeSTAR HS高保真聚合酶擴(kuò)增和割膠回收得到用于同源重組的各個(gè)片段。用YPD培養(yǎng)基活化CENPK21D（以下簡(jiǎn)稱NK2）后將各個(gè)片段利用醋酸鋰法轉(zhuǎn)入感受態(tài)中[11]，并用SMUra固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子再分別用SacIIPGK1/HMG1Asc，PacPDC1p/ERG12Asc，PacENO2p/IDI1Asc，PacPYK1p/ERG19Asc，PacpFBA/ERG13Asc，PacpTDH3/ERG8Asc ，SacIIpTEF1/ERG10Asc，SexAHMG1/PDC1pSexA1，SexA1ERG12/ENO2pSexA1，SexA1IDI1/PYK1pSexA1，SexA1ERG19/pFBASexA1，SexA1ERG13/pTDH3SexA1，SexA1ERG8/pTEF1SexA1等13對(duì)引物對(duì)途徑進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證，得到工程菌NK2SQ。同時(shí)在NK2菌株的GAL7位點(diǎn)整合URA3篩選標(biāo)記，獲得對(duì)照菌NK2SQCK，見(jiàn)表1。

22NK2LUP系列菌株的構(gòu)建構(gòu)建NK2LUP工程菌株所采用的方法與21相同，見(jiàn)圖3，表3。首先，Group B中模板和引物的搭配方案，用PrimeSTAR HS高保真聚合酶擴(kuò)增和割膠回收得到用于同源重組的各個(gè)片段。然后用SMUra培養(yǎng)基活化NK2SQ菌株并利用醋酸鋰方法制備成感受態(tài)細(xì)胞，將各個(gè)片段轉(zhuǎn)入感受態(tài)中[11]，用SMUraTrp固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子用引物SacIIPGK1/LUPAsc進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證后，得到工程菌NK2LUP，見(jiàn)表1。

23搖瓶發(fā)酵方法及產(chǎn)物提取方法挑取平板上的單克隆于相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，30 ℃，250 r·min-1。將種子液接種于含15 mL YPD培養(yǎng)基的100 mL的三角瓶中，30 ℃，250 r·min-1振蕩培養(yǎng)6 d后，進(jìn)行產(chǎn)物的提取。產(chǎn)物提取的方法如下：取2 mL的發(fā)酵液于破碎管中，13×103 r·min-1離心3min，去培養(yǎng)基，無(wú)菌水清洗后，加入適量玻璃珠（直徑為05 mm）和05 mL丙酮，震蕩破碎5 min，

超聲破碎30 min，13×103 r·min-1離心3 min，取上清。重復(fù)處理第2次，合并上清。上清過(guò)022 μL有機(jī)尼龍濾膜后備用。

24鯊烯及羽扇豆醇的檢測(cè)方法GCMS測(cè)定：進(jìn)樣口溫度300 ℃，進(jìn)樣體積1 μL，不分流，溶劑延時(shí)12 min；色譜柱HP5 ms（025 mm×30 m）；色譜條件為80 ℃，1 min；20 ℃·min-1到300 ℃保溫18 min；MS條件為SIM 69，109，135，363，411；羊毛甾醇，麥角固醇、鯊烯和羽扇豆醇標(biāo)準(zhǔn)品用于定性和定量分析。

3結(jié)果與分析

31一步法完成多倍化MVA生物合成途徑植物天然產(chǎn)物的生物合成涉及到多步酶促反應(yīng)，如從倍半萜共同前體FPP開(kāi)始合成青蒿素前體青蒿酸就需要6條功能基因參與[10]；另外，紫杉醇和嗎啡等化合物的酶反應(yīng)步驟均超過(guò)10步[1516]。因此，在微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建過(guò)程中實(shí)現(xiàn)基因的高通量重組顯的十分重要。在本研究中，嘗試對(duì)由7個(gè)功能基因組成的MVA合成途徑進(jìn)行一步法組裝：首先將MVA途徑中的ERG10，ERG13，tHMG1，ERG12，ERG8，ERG19和IDI1 7個(gè)基因進(jìn)行PCR克隆，并分別與相應(yīng)的強(qiáng)啟動(dòng)子TEF1，F(xiàn)BA1，PGK1，PDC1，TDH3，PYK1，ENO2和終止子連接后，利用同源重組一次整合到NK2基因組的GAL7位點(diǎn)（URA3為篩選標(biāo)記）。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)缺陷培養(yǎng)基的篩選后，分別用相應(yīng)的引物對(duì)整合途徑進(jìn)行PCR和測(cè)序驗(yàn)證后得到工程菌NK2SQ。PCR和測(cè)序結(jié)果顯示，該方法可在釀酒酵母中一次性完成9個(gè)基因片段，約20 kb總基因長(zhǎng)度的整合，見(jiàn)圖2，4。

MTrans2K plus marker；左圖泳道1～77個(gè)基因及相應(yīng)的啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物條帶；左圖泳道8～13驗(yàn)證7個(gè)基因是否串聯(lián)在一起的PCR產(chǎn)物條帶；右圖泳道1URA3 marker整合到NK2SQCK菌株P(guān)CR驗(yàn)證結(jié)果。

32MVA途徑的優(yōu)化對(duì)釀酒酵母萜類產(chǎn)量的影響MVA途徑作為細(xì)胞中乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為萜類化合物的第1個(gè)關(guān)鍵模塊，其活性會(huì)直接影響到細(xì)胞中萜類產(chǎn)量[17]。經(jīng)過(guò)對(duì)工程菌NK2SQ中鯊烯、羊毛甾醇和麥角固醇等萜類產(chǎn)量的分析發(fā)現(xiàn)：MVA途徑的多倍化能顯著提高菌株NK2SQ萜類的合成能力，其中三萜通用前體物質(zhì)鯊烯的產(chǎn)量達(dá)到（35400±228）mg·L-1，較對(duì)照菌NK2SQCK提高了500倍，見(jiàn)圖5。另外麥角固醇和羊毛甾醇等下游萜類含量變化不顯著，可能是由于釀酒酵母內(nèi)源的麥角固醇生物合成途徑受到嚴(yán)格調(diào)控所致[18]。

33羽扇豆醇細(xì)胞工廠構(gòu)建及產(chǎn)物分析鯊烯可在酵母內(nèi)源的環(huán)氧鯊烯合酶催化下形成2，3環(huán)氧鯊烯，在釀酒酵母中引入擬南芥來(lái)源的羽扇豆醇合成酶可催化2，3環(huán)氧鯊烯環(huán)化形成羽扇豆醇[24]。首先，將通過(guò)密碼子優(yōu)化和全基因合成的AtLUP基因，與強(qiáng)啟動(dòng)子PGK1和終止子ADH1連接后，整合到三萜底盤菌株NK2SQ基因組的HIS3位點(diǎn)（TRP1為篩選標(biāo)記），轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)缺陷培養(yǎng)基的篩選及PCR與測(cè)序驗(yàn)證后得到工程菌NK2LUP，見(jiàn)圖

3，6。NK2LUP在YPD培養(yǎng)基中發(fā)酵6 d后，利用GCMS對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析發(fā)現(xiàn)工程菌株NK2LUP能發(fā)酵生產(chǎn)羽扇豆醇，見(jiàn)圖7。其產(chǎn)量達(dá)到（823±118） mg·L-1見(jiàn)圖8；與出發(fā)菌NK2SQ相比，三萜的通用前體鯊烯和其內(nèi)源衍生物羊毛甾醇和麥角固醇的總量未見(jiàn)明顯改變，分別為40726，41332 mg·L-1，但中間體鯊烯的積累依然很充足，產(chǎn)量為（35335±378） mg·L-1，見(jiàn)圖8。

4討論

目前，雖然人們發(fā)現(xiàn)樺木酸等羽扇豆烷型三萜具有很出色的抗癌、抗HIV等生物學(xué)活性[1920]，但是此類化合物基本都是從植物中直接提取，對(duì)植物資源有很高的依賴性和破壞性。釀酒酵母為安全的模式真核生物，含有可供萜類合成的MVA途徑，且利用釀酒酵母生產(chǎn)萜類化合物也已經(jīng)有了很多成功的案例，如科學(xué)家們已構(gòu)建了生產(chǎn)青蒿酸[10]、丹參酮[21]、人參苷元[1112]等萜類化合物的釀酒酵母細(xì)胞工廠。本研究中，首先通過(guò)一步法在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)了約20 kb基因長(zhǎng)度的MVA途徑精確重組，構(gòu)建了高產(chǎn)鯊烯的三萜底盤釀酒酵母細(xì)胞工廠NK2SQ。然后，將擬南芥來(lái)源的AtLUP基因整合至底盤菌株NK2SQ基因組中，創(chuàng)建了可生產(chǎn)羽扇豆烷的釀酒酵母細(xì)胞工廠NK2LUP。然而，目前工程菌株中羽扇豆醇的轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)量均很低，這一現(xiàn)象可能是環(huán)氧鯊烯合酶（ERG1）是三萜合成途徑中的一個(gè)限速酶[11]，未過(guò)表達(dá)ERG1導(dǎo)致羽扇豆醇合酶AtLUP的底物2，3環(huán)氧鯊烯供給不足造成的；亦或是植物源蛋白AtLUP在釀酒酵母中進(jìn)行異源表達(dá)且只有單個(gè)拷貝時(shí)，酶活及表達(dá)量不足造成的；亦或是二者兼而有之。下步工作將主要圍繞鯊烯至羽扇豆醇的代謝途徑進(jìn)行優(yōu)化。本研究完成了羽扇豆醇釀酒酵母人工細(xì)胞工廠的構(gòu)建，為進(jìn)一步獲得羽扇豆烷型三萜細(xì)胞工廠提供了基礎(chǔ)，同時(shí)為酵母中實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生物合成途徑精確組裝提供技術(shù)支持。

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[責(zé)任編輯呂冬梅]