王　新，周　昱，廉奇鑫

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江佳木斯154003)

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乳腺癌生發(fā)過程中WWOX和Caspase－9的表達①

王新，周昱，廉奇鑫

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江佳木斯154003)

摘要:目的: WWOX、Caspase－9兩因子通過檢測是否在人體乳腺癌組織有表達，并分析WWOX、Caspase－9在乳腺癌組織中的表達特點，研究兩者關系。方法:在乳腺正常組織、乳腺癌組織中應用Elivision法測50例正常乳腺組織、乳腺癌組織中，同時整理患者的病理資料進行統(tǒng)計學。結(jié)果:在原位癌以及正常乳腺組織、浸潤癌組織中的陽性表達率分別是40.00% (18/45) ;53.85%(7/13)，76.92%(10/13)，66.67% (8/12)，58.33% (7/12)，75.56% (34/45)。且WWOX、Caspase－9每組兩兩相互比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)論:①WWOX在乳腺癌組織中呈高表達，Caspase－9在乳腺癌中呈低表達。②WWOX、Csapase－9可能與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預后有關。

關鍵詞:乳腺癌; WWOX、Caspase－9;免疫組織化學Elivision法

在惡性腫瘤中乳腺癌現(xiàn)今已經(jīng)成為女性最常見的惡性腫瘤之一［1］，我國女性乳腺癌在我國所有惡性腫瘤中比例為7%～10%并且呈上升狀態(tài)。無論在國內(nèi)外乳腺癌都是女性常見的惡性腫瘤之一，世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，全球每年有至少120萬女性診斷為乳腺癌，50萬人死于本病。在發(fā)達國家有報道顯示乳腺癌是女性惡性腫瘤中的第1位，比例約為32%［2］。

WWOX (ww domain contaming oxidoreductase)因子是近些年新發(fā)現(xiàn)的新抑癌基因［3］，它是在人類染色體16q23.3－q24.1中發(fā)現(xiàn)的，它含有414個氨基酸。WWOX因子內(nèi)含有一個特殊的氧化還原酶它其中的短鏈(short－ehaindehydrogenase reauetasedomainSRD)，國內(nèi)外學著研究表明WWOX可與ER、雌二醇相結(jié)合［3］，并作用于這兩個因子上。

半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶－9(Caspase －9)、在人體染色體1號染色體短臂中(p36.3p 36.1)發(fā)現(xiàn)該因子，Caspase－9它的結(jié)構(gòu)非常特殊常以無活性酶原結(jié)構(gòu)存在，至今為止只發(fā)現(xiàn)Caspase－9含有N末端的原域、大亞單位的20KD和小亞的10KD單位。而該區(qū)域中又包含了死亡效應區(qū)域DED和Caspase聚集區(qū)域CARD，且DED和CARD屬于死亡域超家族。本實驗應用研究Elivision法檢驗WWOX、Caspase－9兩因子分別在50例乳腺癌、50例癌旁正常組織中的表達情況，并探索WWOX、Caspase－9兩因子在乳腺中是否有關系及可能存在的臨床意義。

1　資料與方法

1.1標本來源

在佳木斯大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科選取2014 －01～2015－05進行手術患者，并籌集術中切除的乳腺標本，通過病理科知深大夫給予冰凍切除術及術后免疫組化結(jié)果選定正常乳腺組織及正常良性組織13例、原位癌12例以及浸潤癌45例共計70例均為女性，年齡25～66歲。并查詢病理編號，在借用病理科存檔蠟塊，選取術前術后均未放療以及化療內(nèi)分泌治療靶向治療等。

1.2主要試劑

從北京博奧森生物有限公司購買WWOX兔抗單克隆抗體以及Caspase－9兔抗單克隆抗體，通用Elivision法試劑盒以及DAB顯色試劑都是從北京中衫金橋生物技術有限公司買入。

1.3免疫組化

通過(Elivision法)研究乳腺癌及正常組織中WWOX、Caspase－9是否有表達。

1.4結(jié)果判定

WWOX主要以細胞核表達，其表達陽性為內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒、而Caspase－9在細胞漿內(nèi)表達，其陽性為出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒。應用雙盲法觀察所有切片并計數(shù)，著色強度明顯強于背景處計數(shù)。每張病理切片至少在高倍鏡下(×200)觀察不重復的視野10個，以每視野中有100細胞計算其中陽性細胞數(shù)。Elivision法結(jié)果根據(jù)陽性細胞所占百分比和染色強度分別計分，前者計分按0分為≤0% ～10%，1分為10%～25%，2分為26%～50%，3分為為51%～75%，4分為75%～100%。后者計分按0分為無色，1分為淡黃色，2分為黃色，3分為黃褐色，兩者乘積: (－)為0～3分，(+ )為4～6分，()為7～9分，()為10～12分，其中“–”示為陰性表達，“+”以上示為陽性表達。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析，采用均數(shù)±標準差(±s)的方式對計量數(shù)據(jù)資料進行表示，采用t進行檢驗，蛋白表達的陽性表達等計數(shù)數(shù)據(jù)資料以率來表示，采用χ2檢驗或Fish檢驗，WWOX、Caspase－9蛋白表達的相關性分析采用Spearman等級相關性分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1 WWOX在正常乳腺組織、乳腺癌組織中的表達

正常乳腺組織、原位癌、浸潤癌中WWOX、Caspase－9蛋白表達水平，見表1～2。

表1　三組間WWOX表達水平

表2　三組間Caspase－9表達水平

WWOX蛋白在13例正常乳腺組織中陽性表達為10例，陽性表達率為76.92%;在12例乳腺原位癌中陽性表達為8例，陽性表達率為66.67%;在45例乳腺浸潤癌中陽性表達為18例，陽性表達率為40.00%。Caspase－9蛋白在13例正常乳腺組織中陽性表達為7例，陽性表達率為53.85%;在12例乳腺原位癌中陽性表達為7例，陽性表達率為58.33%;在45例乳腺浸潤癌中陽性表達為34例，陽性表達率為75.56%。通過秩和檢驗我們可看出(表1，2) WWOX和Caspase－9分別在正常乳腺組織、原位癌、浸潤癌中兩兩比較，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2浸潤癌中WWOX與Caspase－9蛋白表達水平見表3～4。

表3　浸潤癌中WWOX表達水平

表4　浸潤癌Caspase－9表達水平

WWOX蛋白在16例浸潤癌I期乳腺組織中陽性表達為10例，陽性表達率為62.50%;在14例浸潤癌II期乳腺組織中陽性表達為5例，陽性表達率為35.71%;在15例浸潤癌III期乳腺組織中陽性表達為3例，陽性表達率為20.00%。Caspase－9蛋白在16例浸潤癌I期乳腺組織中陽性表達為9例，陽性表達率為56.25%;在14例浸潤癌II期乳腺組織中陽性表達為11例，陽性表達率為78.57%;在15例浸潤癌III期乳腺組織中陽性表達為14例，陽性表達率為93.33%。通過秩和檢驗我們可看出(表3，4) WWOX和Caspase－9分別在浸潤癌I期、潤癌II期、浸潤癌III期中兩兩比較，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3乳腺癌生發(fā)過程中WWOX與Caspase－9蛋

白的相關性

①正常乳腺組織、原位癌、浸潤癌中WWOX與Caspase－9的相關性:在36例WWOX陽性表達的乳腺組織中Caspase－9陽性表達的例數(shù)為16例，在24例Caspase－9陰性表達的的乳腺組織中WWOX陰性表達的例數(shù)為4例，且兩組數(shù)據(jù)差異比較具有統(tǒng)計學意義(χ2= 5，P＜0.05)，用統(tǒng)計學方法Spearman分析，結(jié)果為二者在正常乳腺組織、原位癌、浸潤癌組織中表達呈負相關(rs=－0.336，P＜0.05)，提示二者在乳腺癌生發(fā)過程中起到了負相關作用，見表5。

表5　正常乳腺組織、原位癌、浸潤癌中WWOX與Caspase－9的相關性

②乳腺癌中WWOX與Caspase－9的相關性: 在26例WWOX陽性表達的乳腺癌組織中Caspase －9陽性表達的例數(shù)為14例，在16例Caspase－9陰性表達的的乳腺癌組織中WWOX陰性表達的例數(shù)為4例，且兩組數(shù)據(jù)差異比較具有統(tǒng)計學意義(χ2= 5.77，P＜0.05)，用統(tǒng)計學方法Spearman分析，結(jié)果為二者在乳腺癌組織中表達呈負相關(rs=－0.369，P = 0.005)，提示二者在乳腺癌中起到了負相關作用，并且隨著病情加重負相關性加大，見表6。

表6　原位癌、浸潤癌中WWOX與Caspase－9的相關性

3討論

乳腺癌的發(fā)生與致癌基因的激活、抑癌基因的失活或缺失有密切關系。2000年Bednarek等人鑒定出的新基因WWOX可與多種腫瘤的發(fā)生有一定

關聯(lián)，如在食管癌，胃癌，肺癌，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌等惡性腫瘤中都出現(xiàn)不同程度的WWOX基因外顯子丟失、雜合性缺失及的表達降低等異常表達［5］。前人對WWOX、Caspase－9在各種惡性腫瘤的表達已經(jīng)進行了初步研究，并且在乳腺癌中也有研究，有過相同的觀點。WWOX在浸潤癌中的陽性表達明顯低于乳腺原位癌組織，兩者比較(P＜0.05)差異均有統(tǒng)計學意義。Caspase－9在浸潤癌中的陽性表達明顯高于乳腺原位癌組織。根據(jù)本實驗的WWOX和Caspase－9在乳腺癌組織中陽性表達數(shù)據(jù)，WWOX、Caspase－9同時陽性表達的例數(shù)為14例，WWOX、Caspase－9同時陰性表達的例數(shù)為4例，且兩組數(shù)據(jù)差異比較具有統(tǒng)計學意義(χ2= 5.77，P＜0.05)，用統(tǒng)計學方法Spearman分析，結(jié)果為二者在乳腺癌組織中表達呈負相關(rs=－0.369，P＜0.05)。本實驗希望通過WWOX、Caspase－9在乳腺癌生發(fā)過程中的表達以及在病理、臨床分其中數(shù)據(jù)與結(jié)果，能為檢測乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、治療等方面提供新的依據(jù)，為治療提供新思路。

參考文獻:

［1］王新，范立君，李壯，等.GRP78、GRP94在乳腺癌中的表達及其意義［J］.黑龍江醫(yī)藥科學，2014，37(6) : 89－91

［2］王博，王宇，李壯.雙側(cè)乳腺癌24例診治分析［J］.黑龍江醫(yī)藥科學，2004，27(2) : 21

［3］Guler G，Uner A，Guler N，et al.The fragile genes FHIT and WWOX are inactivated coordinately in invasive breast carcinoma［J］.Cancer，2004，100(8) : 1605－1614

［4］Ried K，F(xiàn)innis M，Hobson L，et al.Common chromosomal fragile site FRA16D sequence: Identification of the FOR gene spanning FRA16D and homozygous deletions and translocation breakpoints in cancer cells［J］.Hum Mol Genet，2010，9: 1651－1663

［5］Chang NS，Doherty J，Ensign A，et al.WOX1 is essential for tumor necrosis factor，UV light，staurosporine，and p53－mediated cell death，and its tyrosine 33－phosphorylated form binds and stabilizes serine 462 phosphorylated p53［J］.Biol Chem，2005，280(52) : 43－100，108

(收稿日期:2015－12－07)

通訊作者:周昱(1969～)男，黑龍江集賢人，學士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導師。E－mail: zhouyu731@126.com。

作者簡介:王新(1962～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導師。

基金項目:①黑龍江省衛(wèi)生廳科研項目，編號: 2013244。

中圖分類號:R737.9

文獻標識碼:B

文章編號:1008－0104(2016) 02－0016－02