趙玥明，滿朝新，曲艷艷，姜　霞，姜毓君，(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院/乳品科學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱　50030;東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱　50086)

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環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測肉中金黃色葡萄球菌

趙玥明1，滿朝新2，曲艷艷1，姜霞1，姜毓君1，2
(1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院/乳品科學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱150030;2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150086)

摘要:應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)建立了對肉中金黃色葡萄球菌檢測的方法。實驗中，使用了最新的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶完成LAMP擴增反應(yīng)，并針對金黃色葡萄球菌所特有的保守性耐熱核酸酶基因(nuc)設(shè)計得到了一套LAMP擴增引物。對LAMP法和PCR法的檢測靈敏度進行了比較，同時對人工污染肉中的金黃色葡萄球菌進行檢測。結(jié)果表明:所建立的LAMP法能夠特異性的檢測金黃色葡萄球菌，并且檢測金黃色葡萄球菌純菌的靈敏度為2.01×100CFU/mL，是普通PCR檢測靈敏度的100倍。在檢測肉中金黃色葡萄球菌時，檢測限為2.01×101CFU/mL。因此，本實驗所建立的LAMP法檢測肉中金黃色葡萄球菌的方法，具有靈敏、快速以及簡便等的優(yōu)點，是一種具有很好的發(fā)展前景的檢測手段。

關(guān)鍵詞:環(huán)介導(dǎo)等溫擴增;金黃色葡萄球菌;肉

常見的食源性致病菌主要有金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核增生性李斯特菌等，其中金黃色葡萄球菌是一類在人類和動物中常見的病原體［1］，可以引起皮膚和軟組織感染、敗血癥、骨髓炎和肺炎等疾?。?，3］。該菌種通過傳染及毒素介導(dǎo)而導(dǎo)致食物中毒［2］。有文獻已經(jīng)報道了金黃色葡萄球菌在肉、牛奶以及奶酪等食品中導(dǎo)致了食源性疾病的暴發(fā)［4-6］，因而檢測肉中的金黃色葡萄球菌方法的建立有著很重要的作用。

進入21世紀以來，分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在各個檢測領(lǐng)域［7］。目前針對食源性致病菌的快速檢測方法，主要集中在PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)、ELISA法、生物傳感器技術(shù)等，但都存在著一定程度上的不足［8］。例如，PCR技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于檢測多種致病菌，但是PCR技術(shù)需要昂貴的熱循環(huán)儀器，經(jīng)驗豐富的實驗人員并且需要擴增幾個小時［9］。為了克服PCR技術(shù)的不足，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一門新技術(shù)，在60～65℃之間進行恒溫擴增［10］。該擴增反應(yīng)通過自主序列復(fù)制和鏈置換的擴增方式，使得擴增產(chǎn)物形成類似花椰菜結(jié)構(gòu)，電泳時呈現(xiàn)出階梯式圖譜，在1h內(nèi)完成反應(yīng)，因此縮減了檢測時間，并且LAMP反應(yīng)可在水浴鍋中進行，極大的降低實驗成本［11］。因此，該方法具有準確、快速、簡便等的特點。

本實驗應(yīng)用最新研發(fā)出來的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶進行LAMP反應(yīng)體系的構(gòu)建，使得較之前的大片段DNA聚合酶所構(gòu)建的LAMP反應(yīng)［9，12，13］，該酶在2012年首次得以應(yīng)用［14］。根據(jù)實驗結(jié)果可知，該酶具有許多優(yōu)點，例如，可以提高反應(yīng)速率，提高持續(xù)的合成能力，較普通的Bst大片段DNA聚合酶具有更好的熱穩(wěn)定性［14-16］。本實驗所建立的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測肉中金黃色葡萄球菌的方法，達到了更為穩(wěn)定、快速、特異、靈敏的檢測目的，具有更好的應(yīng)用前景。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實驗所用菌株見表1。

Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶，New England Biolabs;細菌基因組DNA提取試劑盒以及Taq PCR Master-Mix，北京天根生物技術(shù)有限公司;甜菜堿(Betaine)，美國Sigma公司; dNTP，北京天根生物技術(shù)有限公司; DNA marker，北京百泰克生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖，西班牙Biowest公司; Tc-25/H型基因擴增儀，美國PCR Kin Elmer Gene Amp; DYY-10C型電泳儀，北京市六一儀器廠; UVP凝膠成像儀，美國UVP公司。

1.2實驗方法

1.2.1不同菌種的培養(yǎng)以及DNA模板的提取取金黃色葡萄球菌ATCC13565作為標準菌株，3株金黃色葡萄球菌(ATCC25923、CMCC26074、CMCC26075)作為參考菌株以及其他25株非金黃色葡萄球菌菌株進行特異性實驗。金黃色葡萄球菌及其他菌種，分別活化培養(yǎng)于NB以及復(fù)合增菌培養(yǎng)基BPW中，37℃培養(yǎng)過夜。分別吸取對數(shù)生長期的菌懸液1mL，采用細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA，將所得到的DNA模板于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　實驗所用菌株及來源

1.2.2 LAMP引物的設(shè)計與合成在GenBank中尋找到金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因(nuc)，該基因具有特異性好的特點，并且具有高度的保守性。因此，本文應(yīng)用此特異性基因nuc序列進行引物的設(shè)計［50，81］。采用在線的Primer Explorer4.0引物設(shè)計軟件，針對特異性的目的片段設(shè)計得到了一套特異性引物，如表2所示。

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化

LAMP反應(yīng)體系(25μL)包括:內(nèi)引物FIP和BIP、外引物F3和B3、MgCl2、脫氧核糖核苷酸(dNTPs)、甜菜堿、DNA模板、10×Buffer、Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶，滅菌水補足體系。將混合物在65℃恒溫60min進行擴增，之后將體系加熱到80℃持續(xù)5min以終止反應(yīng)。選擇對LAMP體系中的關(guān)鍵因素進行優(yōu)化，包括鎂離子濃度(2、4、6、8、10mmol/L)、dNTP濃度(0.4、0.8、1.2、1.6、2mmol/L)、外引物與內(nèi)引物濃度比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)、甜菜堿濃度(0、0.4、0.8、1.2、1.6mol/L)、Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1μL)，根據(jù)LAMP擴增后電泳圖條帶的有無和亮度選擇最適條件，建立LAMP反應(yīng)體系。

表2　金黃色葡萄球菌nuc基因LAMP引物序列

建立LAMP反應(yīng)體系后，將反應(yīng)體系分別在61℃、62℃、63℃、64℃及65℃條件下進行擴增反應(yīng)，確定最適反應(yīng)溫度。并在確認的最適反應(yīng)溫度下，進行LAMP反應(yīng)，分別擴增15、30、45、60、75min，擴增后進行2%瓊脂糖凝膠電泳，確定LAMP反應(yīng)的最適反應(yīng)條件。

1.2.4 LAMP檢測金黃色葡萄球菌的特異性按照1.2.1的方法，提取4株金黃色葡萄球菌以及其他26株非金黃色葡萄球菌的DNA，分別作為LAMP反應(yīng)的模板，進行擴增反應(yīng)，取擴增后的產(chǎn)物5μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察實驗結(jié)果。

1.2.5 LAMP及PCR方法檢測金黃色葡萄球菌靈敏度的比較應(yīng)用平板計數(shù)法得到初始菌液濃度為2.01× 109CFU/mL。取1mL處于對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)液，用0.85%生理鹽水進行10倍梯度稀釋。用試劑盒對不同濃度的金黃色葡萄球菌菌液提取基因組DNA，并作為模板分別進行PCR和LAMP反應(yīng)。分別取5μL反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，獲得實驗結(jié)果。

建立PCR法檢測金黃色葡萄球菌的反應(yīng)體系為25μL: 12.5μL of Taq PCR MasterMix，1μL F3以及1μL B3，2μL模板DNA，用蒸餾水補足體系至25μL。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，64℃退火45s，72℃延伸30s，30個循環(huán)，72℃延伸5min。取5μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察擴增效果。

1.2.6 LAMP檢測人工污染肉中金黃色葡萄球菌購買鮮肉25g，經(jīng)國標法確認肉中不含金黃色葡萄球菌。按照國標法GB 4789.10—2010，將所購買的25g鮮肉放入含有225mL BPW的無菌均質(zhì)袋中，混勻后每25mL為1組，分裝10組，分別添加109～100CFU/mL不同濃度的金黃色葡萄球菌2.5mL，制成金黃色葡萄球菌濃度為108～10－1CFU/mL的人工污染肉漿，應(yīng)用試劑盒提取每組中的金黃色葡萄球菌DNA作為模板，分別進行LAMP反應(yīng)。

2　結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)體系的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系，確立了最終LAMP反應(yīng)體系為: 0.4mmol/L的F3及B3，2.4mmol/L的FIP和BIP，4mmol/L MgCl2，2mmol/L dNTPs，0.4mol/L甜菜堿，0.9μL的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(8U)，2.5μL 10×Buffer及2μL模板。最佳反應(yīng)條件為:在64℃條件下，對金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC13 565采用優(yōu)化的LAMP體系擴增60min。擴增后電泳結(jié)果如圖1，陽性組呈現(xiàn)出LAMP產(chǎn)物所特有的梯狀條帶，而以滅菌水為模板的空白組，則未出現(xiàn)梯狀條帶。

圖1　金黃色葡萄球菌LAMP檢測結(jié)果

2.2 LAMP檢測金黃色葡萄球菌的特異性

4株金黃色葡萄球菌為模板的泳道均有LAMP特異性的條帶產(chǎn)生，而其他26株非金黃色葡萄球菌均呈陰性，無特異性的梯形條帶。結(jié)果如圖2所示。

2.3 LAMP及PCR法檢測金黃色葡萄球菌靈敏度的比較

原始金黃色葡萄球菌菌液濃度為2.01×109CFU/mL，從圖3可知，2.01×109～2.01×100CFU/mL都有典型的LAMP擴增產(chǎn)物的梯形條帶，而2.01×10－1CFU/mL未見LAMP擴增。由此可見，LAMP方法檢測金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度為2.01×100CFU/mL。對比圖4可知，PCR法檢測金黃色葡萄球菌的靈敏度是2.01× 102CFU/mL。通過比較可知，本實驗所建立的LAMP法檢測金黃色葡萄球菌的檢出限是PCR法的100倍。

圖2　 LAMP檢測金黃色葡萄球菌靈敏度電泳圖

圖3　 PCR檢測金黃色葡萄球菌純菌的靈敏度電泳圖

2.4 LAMP檢測人工污染肉漿中金黃色葡萄球菌的靈敏度

如1.2.6中所示，人工污染肉漿中金黃色葡萄球菌的濃度為2.01×108～2.01×10－1CFU/mL，分別進行LAMP擴增反應(yīng)，LAMP法檢測人工污染肉漿中金黃色葡萄球菌的檢出限為2.01×101CFU/mL (圖4)。

圖4　 LAMP檢測人工污染肉中金黃色葡萄球菌的靈敏度電泳圖

3　討論

目前，基于核酸擴增檢測食源性致病菌的方法已得到了飛速的發(fā)展。針對于金黃色葡萄球菌的檢測方法，主要圍繞著傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定相結(jié)合的方法、PCR法以及熒光定量PCR法［17-19］。近幾年已有應(yīng)用Bst大片段DNA聚合酶進行LAMP擴增檢測金黃色葡萄球菌，但都未從肉基質(zhì)中進行檢測［19］。而本文應(yīng)用了Biolab公司最新研發(fā)出的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶進行LAMP擴增。該酶較傳統(tǒng)的Bst大片段DNA聚合酶的優(yōu)點在于，該酶是熱啟動酶，無需低溫條件下配制反應(yīng)體系，即可保證酶催化反應(yīng)的特異性，從而使反應(yīng)更適合于現(xiàn)場的食源性致病菌檢測，為該方法的實際應(yīng)用創(chuàng)造了更大的可能。經(jīng)比較得知傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)檢測方法需要5d左右，PCR及熒光定量PCR法需要3～4h，LAMP方法只需1h即可擴增109倍從而達到檢測目的［10］。同時，也有報道稱LAMP反應(yīng)不易受食品基質(zhì)中成分的抑制作用，對DNA模板純度要求不高［20］。因此可知，LAMP檢測方法具有快速、特異、靈敏等的優(yōu)點。然而，正因為LAMP方法的高靈敏性，導(dǎo)致了該方法易產(chǎn)生假陽性的污染問題。因此，要特別注意實驗的分區(qū)操作，從而防止假陽性的產(chǎn)生。此外，LAMP檢測方法所具有的高特異性，是由于該方法識別了目的片段的6個區(qū)域，需要設(shè)計4條特異性引物，因而導(dǎo)致了反應(yīng)復(fù)雜因素增多。

本研究應(yīng)用了最新的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶建立了LAMP技術(shù)檢測肉中金黃色葡萄球菌的方法。由于該方法具有靈敏、快速以及簡便的優(yōu)點，使得該方法為基層檢測提供了一個新的思路，具有很好的發(fā)展前景，在食品安全檢測領(lǐng)域有望得到廣泛的應(yīng)用。

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(責(zé)任編輯李燕妮)

Rapid Detection of Staphylococcus aureus in Raw
Meat Samples by Loop-mediated Isothermal Amplification

ZHAO Yue-ming1，MAN Chao-xin2，QU Yan-yan1，JIANG Xia1，JIANG Yu-jun1，2
(1Key Lab of Dairy Science，Ministry of Education，College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China;2National Research Center of Dairy Engineering and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150086，China)

Abstract:We established a method to detect Staphylococcus aureus in meat by loop-mediated isothermal amplification.During the experiment，using the latest Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase to finish the LAMP amplification reaction，and against S.aureus-specific nuclease resistant conserved gene (nuc) designed LAMP amplification primers.the detection sensitivity of LAMP and the PCR method were compured，while was detect Staphylococcus aureus.the artificially contaminated meat The results showed that the built LAMP method could specifically detect Staphylococcus aureus，and Staphylococcus aureus bacteria in pure sensitivity 2.01×100CFU / mL，which was 100 times the normal PCR detection sensitivity.the detection limit of detecting Staphylococcus aureus in meat was 2.01×101CFU / mL.Thus，the LAMP method to detect Staphylococcus aureus in meat was established，which had the advantage of sensitive，rapid and simple，which was a kind of good prospects for development of testing methods．

Keywords:loop-mediated isothermal amplification; Salmonella aureas; meat

通訊作者:姜毓君(1971—)，男，博士，教授，研究方向:食品科學(xué)。

作者簡介:趙玥明(1990—)，女，在讀博士研究生，研究方向:食品科學(xué)。

基金項目:國家科技支撐計劃課題(項目編號: 2012BAD28B02、2013BAD18B11、2012BAD29B07)。