曹月誠(chéng)，羨海英 ，陳登峰，吳剛

(1衡水市哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院，河北衡水053000；2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

人肺腺癌A549細(xì)胞上清液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

曹月誠(chéng)1，羨海英1，陳登峰1，吳剛2

(1衡水市哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院，河北衡水053000；2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

目的 探討人肺腺癌A549細(xì)胞上清液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖、遷移和侵襲能力的影響。方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs，分別加入培養(yǎng)24、48 h的A549細(xì)胞上清液(分別記為 24 h組和 48 h組)，對(duì)照組僅加入高糖DMEM培養(yǎng)基。采用MTS法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性，Transwell試驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移及侵襲能力。結(jié)果 與對(duì)照組比較，24 h組和 48 h組HUVECs增殖、遷移和侵襲能力均升高，且24 h組升高更明顯(P<0.05或<0.01)。結(jié)論 A549細(xì)胞上清液可增強(qiáng)HUVECs的增殖、遷移和侵襲能力，以培養(yǎng)24 h的A549細(xì)胞上清液作用較強(qiáng)。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；人肺腺癌A549細(xì)胞；增殖；遷移；侵襲

腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均由血管提供[1]。內(nèi)皮細(xì)胞完成遷移、降解基質(zhì)、侵襲并形成新生的血管，這一系列過(guò)程不僅受全身神經(jīng)體液的影響，同樣也受其所處微環(huán)境的調(diào)控[2, 3]。癌細(xì)胞分泌的各類因子會(huì)影響其周圍的內(nèi)皮細(xì)胞，使其向腫瘤組織的方向生長(zhǎng)，完成萌芽期和發(fā)育期。腫瘤組織一旦與毛細(xì)血管接觸，就會(huì)快速增生甚至轉(zhuǎn)移至其他部位[4]。2013年1月～2014年10月，本研究觀察不同時(shí)段人肺腺癌A549細(xì)胞上清液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖、遷移和侵襲能力的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌A549細(xì)胞及HUVECs均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。高糖DMEM培養(yǎng)基、FBS、0.25% EDTA胰酶、雙抗均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，Transwell培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10% FBS、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549細(xì)胞及HUVECs，2～3天換液，至80%～90%融合時(shí)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行研究。

1.3 不同時(shí)段A549細(xì)胞上清液制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞接種在10 cm2培養(yǎng)皿中，采用含10% FBS、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3天換液。至90%融合時(shí)，換10 mL的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24、48 h。收集上清液，2 000 r/min離心10 min，去除死細(xì)胞及雜質(zhì)，濾器過(guò)濾，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞分組與處理 取饑餓處理后的HUVECs以5 000/孔密度接種于96孔板中，分別加入含5% FBS的培養(yǎng)24 h A549細(xì)胞上清液(24 h組)、48 h A549細(xì)胞上清液(48 h組)和高糖DMEM培養(yǎng)基(對(duì)照組)，培養(yǎng)24 h。

1.5 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.5.1 細(xì)胞增殖活性 采用MTS法。按照MTS細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，將100 μL MTS加入各組孔板中，孵育4 h，495 nm測(cè)定各孔吸光度值。計(jì)算細(xì)胞增殖活性，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.5.2 細(xì)胞遷移能力 采用Transwell遷移試驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs，0.25%胰酶消化后1 000 r/min離心5 min，采用含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基懸浮HUVECs，均勻接種在Transwell培養(yǎng)板上室，每個(gè)小室2×104個(gè)細(xì)胞。下室內(nèi)分別為含有20% FBS的培養(yǎng)24 h、48 h A549細(xì)胞條件培養(yǎng)基和對(duì)照DMEM培養(yǎng)基，分別記為24 h組、48 h組和對(duì)照組。16 h后取出上室，使用棉簽小心擦除膜上面的細(xì)胞，90%乙醇固定20 min，0.1%龍膽紫染色15 min。鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野下的細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.5.3 細(xì)胞侵襲能力 采用Transwell侵襲試驗(yàn)。上室加入稀釋Matrigel膠(1∶5 DMEM稀釋)50 μL，放入培養(yǎng)箱2 h以上，凝固待用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs，參照1.5.2的方法均勻接種在預(yù)先處理好的Transwell板上室，每個(gè)小室5×104個(gè)細(xì)胞。下室內(nèi)分別為含有20% FBS的培養(yǎng)24 h、48 h A549細(xì)胞條件培養(yǎng)基和對(duì)照DMEM培養(yǎng)基，分別記為24 h組、48 h組和對(duì)照組。24 h后取出上室，使用棉簽小心擦除膜上面的細(xì)胞，90%乙醇固定20 min，0.1%龍膽紫染色15 min。鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野下的細(xì)胞數(shù)，取平均值。

2 結(jié)果

與對(duì)照組比較，24 h組和48 h組HUVECs增殖、遷移和侵襲能力均升高，且24 h組升高更明顯(P<0.05或<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 三組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.01；與48 h組比較，△P<0.05，▲P<0.01。

3 討論

腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)自分泌和旁分泌的方式產(chǎn)生大量的生長(zhǎng)因子，作用于本身或鄰近細(xì)胞，從而引起本身或鄰近細(xì)胞的應(yīng)答，造成腫瘤細(xì)胞增殖、新生血管形成以及免疫應(yīng)答減弱等[5]。由于血管生成在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，故以腫瘤血管為目標(biāo)的抗血管生成治療成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)[6]。體外研究表明，腫瘤細(xì)胞分泌的上清液可以產(chǎn)生多種作用。肖衡等[7]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞分泌的上清液可以使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，有利于腫瘤基質(zhì)的形成，并能促進(jìn)血管的生長(zhǎng)。牛云等[8]發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞上清液可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化。

肺癌病死率居各種惡性腫瘤之首[8]。A549細(xì)胞系不但是體外研究Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞藥物代謝的模式細(xì)胞,也是體外研究肺腺癌治療效果的常用細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞上清液不但可以影響樹突狀細(xì)胞的增殖，降低機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫殺傷作用；也可以誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為更利于腫瘤血管生成的肌成纖維細(xì)胞，最重要的是可以直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞而促進(jìn)血管生成，從而為腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)支持[9]。

遷移是細(xì)胞從不利于生長(zhǎng)的環(huán)境向有利于生長(zhǎng)的環(huán)境轉(zhuǎn)移的化學(xué)趨向性，侵襲是細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶等酶類以分解組織基質(zhì)的能力，二者都是內(nèi)皮細(xì)胞形成血管的必備能力。有報(bào)道顯示，HUVECs與腫瘤細(xì)胞上清液混合培養(yǎng)的生長(zhǎng)環(huán)境類似于細(xì)胞在人體腫瘤內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，24 h組和48 h組HUVECs增殖、遷移和侵襲能力均升高，且24 h組升高更明顯；說(shuō)明A549細(xì)胞上清液可增強(qiáng)HUVECs增殖、遷移和侵襲能力，以培養(yǎng)24 h的A549細(xì)胞上清液作用較強(qiáng)。分析原因，可能是A549細(xì)胞可以分泌大量的生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、粒細(xì)胞集落刺激生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，可以促進(jìn)血管的生成。

綜上所述，A549細(xì)胞上清液可增強(qiáng)HUVECs的增殖、遷移和侵襲能力，以培養(yǎng)24 h的A549細(xì)胞上清液作用較強(qiáng)，但是其具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

[1] 鄧海濱,王中奇,徐振曄.肺巖寧方對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管腔形成的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2009,7(3):255-260.

[2] 李迎春,田菁,張文琪,等.HMGB1對(duì)腫瘤血管生成體外調(diào)節(jié)作用的觀察[J].山東醫(yī)藥,2013,53(45):8-9.

[3]劉延霞,郭其森.血管生成抑制劑治療肺癌的研究現(xiàn)狀[J].山東醫(yī)藥,2005,45(20):68-69.

[4] Kim DH, Choe YS, Jung KH, et al. Synthesis and evaluation of 4-[(18)F]fluorothalidomide for the in vivo studies of angiogenesis[J]. Nucl Med Biol, 2006,33(2):255-262.

[5] Fukumura D, Duda DG, Munn LL, et al. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models[J]. Microcirculation, 2010,17(3):206-225.

[6] 郭其森,劉秀菊.非小細(xì)胞肺癌的內(nèi)科治療[J].山東醫(yī)藥,2011,51(3):102-104.

[7] 肖衡,杜成友,羅詩(shī)樵,等.不同濃度腫瘤細(xì)胞上清液對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)及表型轉(zhuǎn)化的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,33(23):2454-2458.

[8] 牛云,何旭,王心蕊,等.鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞上清液誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2007,33(4):634-637.

[9] 韓建群,秦偉偉,李宏偉,等.氯化鈷致低氧誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 DLL4表達(dá)上調(diào)并分泌促HUVEC遷移物[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2012,32(3):317-321.

[10] 蔣力,何勇,蔣耀光.Endostar對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及功能的抑制作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,31(21):2069-2072.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.010

R734.2

A

1002-266X(2016)16-0033-02

2015-08-20)