趙燕，宋滇平，王艷，王玲，劉華，楊秋萍

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

2型糖尿病患者Klotho基因G-395A多態(tài)性及其對合并下肢動(dòng)脈粥樣硬化的影響

趙燕，宋滇平，王艷，王玲，劉華，楊秋萍

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

目的 觀察2型糖尿病(T2DM)患者Klotho基因G-395A多態(tài)性，探討其對合并下肢動(dòng)脈粥樣硬化的影響。方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(FQ-PCR)技術(shù)，分別對205例健康體檢者(漢族85例、彝族120例，對照組)、140例T2DM患者(漢族79例、彝族61例，T2DM組)及224例T2DM合并下肢動(dòng)脈粥樣硬化患者(漢族157例、彝族67例，動(dòng)脈硬化組)的Klotho基因G-395A多態(tài)性進(jìn)行檢測，比較各組漢族、彝族基因型頻率、等位基因頻率，分析T2DM合并下肢動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。結(jié)果 動(dòng)脈硬化組漢族Klotho基因G-395A位點(diǎn)GA+AA基因型頻率高于彝族(P<0.05)，其余各組各等位基因及基因型頻率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。漢族T2DM患者發(fā)生下肢動(dòng)脈粥樣硬化的影響因素為SBP、TG、LHL、空腹血糖(FPG)、Klotho基因G-395A位點(diǎn)GA+AA基因型(P均<0.05)，彝族為TG、LHL、FPG、血肌酐(P均<0.05)。結(jié)論 T2DM合并下肢動(dòng)脈粥樣硬化患者存在Klotho基因G-395A多態(tài)性，Klotho基因G-395A位點(diǎn)GA+AA基因型可能是云南省漢族部分T2DM患者發(fā)生下肢動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。

2型糖尿??；下肢動(dòng)脈粥樣硬化；Klotho基因；彝族；漢族；單核苷酸多態(tài)性

大血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，它是糖尿病致死的最主要原因。糖尿病大血管病變主要累及主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈和外周血管等，病理基礎(chǔ)為動(dòng)脈粥樣硬化。Klotho基因是1997年日本學(xué)者 Kuro-O等[1]發(fā)現(xiàn)的、與衰老有關(guān)的基因，該基因缺陷可引起小鼠動(dòng)脈硬化、骨質(zhì)疏松、皮膚萎縮及肺氣腫等疾病。Klotho基因變異在2型糖尿病(T2DM)及動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。彝族是云南省人口最多的少數(shù)民族之一，由于地理、歷史和社會(huì)等原因，已形成獨(dú)特的遺傳隔離人群，有利于進(jìn)行隔離人群遺傳特點(diǎn)研究。目前尚未見對云南彝族Klotho基因G-395A多態(tài)性的相關(guān)研究。本研究觀察T2DM患者Klotho基因G-395A多態(tài)性，探討其對合并動(dòng)脈粥樣硬化的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年10月～2010年4月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及楚雄州醫(yī)院收治的單純T2DM患者140例(T2DM組)，男86例、女54例，漢族79例、彝族61例，糖尿病病程(35.50±25.17)個(gè)月。T2DM合并下肢動(dòng)脈硬化患者224例(動(dòng)脈硬化組)，男116例、女108例，漢族157例、彝族67例，糖尿病病程(51.80±43.79)個(gè)月。T2DM診斷和分型均參照1999年WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)；彩色多普勒超聲顯示股動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度(IMT)≥1.0 mm、局部有斑塊或管腔狹窄診斷為下肢動(dòng)脈粥樣硬化。選擇體檢健康者205例為對照組，男124例、女81例，漢族85例、彝族120例，無糖尿病、高血壓家族史。研究對象均為長期定居云南省昆明市、楚雄市，居住滿20年，三代無外族通婚且相互間無血緣關(guān)系的漢族、彝族居民。三組性別、民族、糖尿病病程比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，其余臨床資料比較見表1。

表1 三組一般臨床資料比較

注：BUN為尿素氮，Scr為血肌酐，F(xiàn)PG為空腹血糖；與對照組比較，aP<0.05；與T2DM組比較，bP<0.05。

1.2 Klotho基因G-395A多態(tài)性檢測 研究對象均禁食12 h，取空腹肘靜脈血4 mL，置于EDTA抗凝管中室溫放置30 min，分離血細(xì)胞、提取DNA。采用上海華舜生物技術(shù)有限公司柱式小量血液DNA抽提試劑盒抽提基因組DNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(FQ-PCR)技術(shù)中的TaqMan熒光探針法檢測G-395A(rs1207568)基因分型。將選定的G-395A(rs1207568)多態(tài)性位點(diǎn)在Applied Biosystems公司網(wǎng)站上查找相應(yīng)的TaqMan-MGB探針，將探針標(biāo)號(hào)及多態(tài)性位點(diǎn)一起送至Applied Biosystems公司合成引物及探針，按照其建議的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系：20×引物及熒光探針混合溶液 0.5 μL，2×TaqMan通用PCR擴(kuò)增預(yù)混試劑7.5 μL，ROX Reference Dye溶液0.3 μL，DNA模板1.5 μL，滅菌蒸餾水5.2 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s、65 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃保溫10 min。使用ABI Prism7300型熒光定量PCR擴(kuò)增儀，按上述PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件設(shè)定擴(kuò)增程序后執(zhí)行，擴(kuò)增完成后根據(jù)FAM和VIC熒光信號(hào)的反應(yīng)曲線，對未知樣本進(jìn)行G-395A基因型分析，分別選取不同基因型送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序，并將測序結(jié)果與Klotho基因序列進(jìn)行Blast比對。采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算各組基因型頻率及等位基因頻率。

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果 G-395A位點(diǎn)存在3種基因型，分別為GG、GA、AA基因型。測序結(jié)果與FQ-PCR技術(shù)的基因分型結(jié)果一致，與Blast比對后顯示一致。見圖1。

2.2 各組彝族、漢族G-395A的基因型分布及等位基因頻率比較 彝族人群Klotho基因 G-395A 的G等位和A等位基因頻率分別為83.9%和16.1%，漢族人群分別為81.8%和82.0%。對照組及T2DM組Klotho基因G-395A位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布在彝族、漢族之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；動(dòng)脈硬化組漢族Klotho基因G-395A位點(diǎn)GA+AA基因型頻率高于彝族(P<0.05)，但二者等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

注：A、B、C箭頭分別對應(yīng)GG、GA、AA基因型。

圖1 G-395A位點(diǎn)3種基因型測序結(jié)果

表2 各組彝族、漢族G-395A基因型及等位基因分布[例(%)]

注：AA型的期望頻數(shù)<5，合并至GA型；與同組漢族比較，*P<0.05。

2.3 T2DM患者發(fā)生下肢動(dòng)脈粥樣硬化的影響因素 分別在漢族、彝族人群中，以糖尿病合并下肢動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生與否作為因變量，選擇表1中兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基本資料及Klotho基因G-395A位點(diǎn)GA+AA基因型為自變量，進(jìn)行多因素Logistic多元回歸分析，結(jié)果顯示漢族T2DM患者發(fā)生下肢動(dòng)脈粥樣硬化的影響因素為SBP、TG、LHL、FPG、Klotho基因G-395A位點(diǎn)GA+AA基因型(P均<0.05)，彝族為TG、LHL、FPG、Scr(P均<0.05)。見表3、4。

表3 漢族T2DM患者發(fā)生下肢動(dòng)脈粥樣硬化影響因素的多元Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

糖尿病與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，國外學(xué)者根據(jù)二者間的相關(guān)性提出了“共同土壤”學(xué)說，認(rèn)為胰島素抵抗是導(dǎo)致心腦血管疾病代謝異常的根本原因。近年來隨著對 Kotho基因研究的深入，發(fā)現(xiàn)Kotho基因不僅是衰老相關(guān)性基因，與衰老相關(guān)病理改變聯(lián)系密切；同時(shí)，其通過相關(guān)分子機(jī)制對個(gè)體多種代謝進(jìn)行干預(yù)，參與冠心病、糖尿病等疾病的發(fā)生、發(fā)展。Klotho基因長50 kb，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，在人和小鼠中均定位于第13號(hào)染色體(13q12)，大鼠中定位于第12號(hào)染色體(12q12)。Klotho基因可通過調(diào)節(jié)某些離子通道、胰島素樣生長因子1(IGF-1)受體等細(xì)胞表面糖蛋白的活性而發(fā)揮作用。Klotho基因缺陷小鼠在出生4周后即可出現(xiàn)動(dòng)脈硬化，并隨鼠齡增加而加重，表現(xiàn)為主動(dòng)脈嚴(yán)重鈣化，肌性中動(dòng)脈中層鈣化、內(nèi)膜增厚、腎臟小動(dòng)脈嚴(yán)重鈣化等，這些血管變化與人類動(dòng)脈硬化非常相似；將外源性正常Klotho基因cDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)給Klotho缺陷小鼠，其動(dòng)脈硬化程度可得到顯著改善[1]。除對Klotho缺陷小鼠進(jìn)行基因補(bǔ)救有效外，對存在多種動(dòng)脈硬化危險(xiǎn)因素的自發(fā)性T2DM大鼠導(dǎo)入Klotho基因同樣可以改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，增加內(nèi)皮細(xì)胞NO合成，減輕血管周圍組織纖維化、逆轉(zhuǎn)血管重塑、降低血壓，對減輕動(dòng)脈硬化具有重要作用[2]。Klotho基因在胰島素和IGF-1信號(hào)通路中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。國內(nèi)研究顯示，T2DM患者血漿Klotho水平低于正常對照者，且胰島素敏感指數(shù)是血漿Klotho水平的獨(dú)立影響因素，提示Klotho基因可能參與胰島素抵抗和T2DM的發(fā)生、發(fā)展，機(jī)制考慮為Klotho參與抗氧化應(yīng)激、抗凋亡、改善內(nèi)皮功能等[3]。

表4 彝族T2DM患者發(fā)生下肢動(dòng)脈粥樣硬化影響因素的多元Logistic回歸分析結(jié)果

Klotho基因含有400多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，人類Klotho 基因多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與動(dòng)脈硬化性疾病相關(guān)，如Kl-VS等位基因、G-395A多態(tài)性、C1818T多態(tài)性等[4,5]。其中G-395A位于啟動(dòng)子區(qū)，Klotho基因G-395A多態(tài)性可影響啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄過程，電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)顯示，由G等位基因形成的DNA蛋白復(fù)合物的量明顯高于由A等位基因形成的量，提示G突變?yōu)锳可能通過減少蛋白和啟動(dòng)子的結(jié)合而影響Klotho基因的功能[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，G-395A位點(diǎn)可影響冠心病、血管性卒中、血脂異常、糖尿病、骨質(zhì)疏松、胃癌等疾病的危險(xiǎn)性[5,7,8]，是重要的遺傳篩選標(biāo)記及潛在的功能性多態(tài)性位點(diǎn)。

本研究的研究對象均為長期定居云南省昆明市、楚雄市，居住滿20年，三代無族外通婚且相互間無血緣關(guān)系的漢族、彝族居民。結(jié)果顯示，彝族人群Klotho基因 G-395A 的G等位和A等位基因頻率分別為83.9%和16.1%，漢族人群分別為81.8%和82.0%，與韓國、日本人群接近[5,9]。動(dòng)脈硬化組漢族Klotho基因G-395A位點(diǎn)GA+AA基因型頻率高于彝族，提示漢族、彝族存在Klotho基因G-395A多態(tài)性；多元回歸分析顯示，漢族人群中糖尿病下肢動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與SBP、TG、LDL、FPG、Klotho基因G-395A位點(diǎn)GA+AA基因型相關(guān)，彝族人群則與FPG、TG、LDL、Scr相關(guān)。T2DM患者由于高血糖的長期刺激可導(dǎo)致其血糖、血脂、肝腎功能發(fā)生病理損傷，影響內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)下肢動(dòng)脈血栓的形成。Klotho基因與T2DM患者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化之間的關(guān)系復(fù)雜，目前認(rèn)為Klotho基因減輕動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制可能包括：①增加NO的合成。Klotho基因缺陷小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞NO合成明顯下降，經(jīng)過與野生型小鼠進(jìn)行聯(lián)體結(jié)合后其NO合成可得到明顯改善[10]。NO是擴(kuò)張血管的主要化合物，可抑制血管平滑肌細(xì)胞增生，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。②抑制p53/p21表達(dá)，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[11]。p53/p21是衰老促進(jìn)基因，對其抑制可以減緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老的進(jìn)程。③促進(jìn)新生血管形成。研究顯示，Klotho基因敲除小鼠血管生成受到抑制[12]。Klotho基因敲除可引起骨質(zhì)疏松、骨髓抑制等骨髓微環(huán)境改變，導(dǎo)致內(nèi)皮前體細(xì)胞生成減少，其分化及遷移功能受損，抑制新生血管生成，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[11,13]。

綜上所述，云南省漢族、彝族部分T2DM合并下肢動(dòng)脈粥樣硬化患者存在Klotho基因G-395A多態(tài)性，Klotho基因G-395A位點(diǎn)GA+AA基因型可能是漢族T2DM患者發(fā)生下肢動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。

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G-395A polymorphisms of Klotho gene in type 2 diabetes mellitus patients and its influence on combined lower limb atherosclerosis

ZHAOYan,SONGDianping,WANGYan,WANGLing,LIUHua,YANGQiuping

(TheFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalCollege,Kunming650032,China)

Objective To observe the G-395A polymorphisms of Klotho gene in type 2 diabetes mellitus (T2DM) patients, and to investigate its influence on combined lower limb atherosclerosis. Methods The G-395A polymorphisms of Klotho gene from 205 cases of normal controls (85 cases of Han nationality, 120 cases of Yi nationality, control group), 140 cases of T2DM patients (79 cases of Han nationality, 61 cases of Yi nationality, T2DM group) and 224 cases of patients with lower limb atherosclerosis combined with T2DM (157 cases of Han nationality, 67 cases of Yi nationality, atherosclerosis group) were detected by real-time fluorescence quantification PCR (FQ-PCR). The genotype frequency and allele frequency were compared between each group, and the risk factors of T2DM combined with lower limb atherosclerosis were analyzed. Results The genotype frequency of Klotho gene G-395A site G/A+A/A in the atherosclerosis group of Han nationality was higher than that of Yi nationality (P<0.05). There was no significant difference in genotype and allele frequency among the rest groups (allP>0.05). The influence factors of T2DM patients with lower extremity atherosclerosis in Han nationality were systolic blood pressure, TG, LHL, fasting blood-glucose (FPG) and genotype of Klotho gene G-395A site G/A+A/A (allP<0.05). The influence factors of T2DM patients with lower extremity atherosclerosis in Yi nationality were TG, LHL, FPG and serum creatinine (allP<0.05). Conclusions There is gene polymorphism at G-395A of Klotho gene in T2DM patients with lower limb atherosclerosis. The Klotho gene G-395A site G/A+A/A genotype may be a genetic risk factor for the occurrence of lower limb atherosclerosis of T2DM patients in Han nationality.

diabetes mellitus, type 2; lower limb atherosclerosis; Klotho gene; Yi nationality; Han nationality; single nucleotide polymorphisms

云南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2009CD166)。

趙燕(1979-)，女，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)樘悄虿〖捌渎圆l(fā)癥的診治。E-mail: yanny8080@sohu.com

楊秋萍(1964-)，女，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)閮?nèi)分泌與代謝性疾病的診治。E-mail: yqp22@sohu.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.004

R587.1

A

1002-266X(2016)28-0012-04

2015-12-01)