解澎，任景麗，汪文杰，虎建恩，胡桂明，吳會芳，牛海鷗

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450014)

回族Lynch綜合征一家系錯配修復(fù)基因表達(dá)及突變情況分析

解澎，任景麗，汪文杰，虎建恩，胡桂明，吳會芳，牛海鷗

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450014)

目的 分析回族Lynch綜合征一家系錯配修復(fù)基因(MMR)表達(dá)及突變情況，探討回族Lynch綜合征的基因特點。方法 先證者男性，37歲，第4代，回族，直腸低分化腺癌。本家系現(xiàn)存6代(均為回族)，共有結(jié)直腸癌患者14例，在世7例。提取本家系中6例患者及5例正常人外周血及腫瘤組織DNA。采用DNA測序檢測腫瘤細(xì)胞DNA微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)，采用免疫組化法檢測腫瘤細(xì)胞MMR表達(dá)，采用PCR技術(shù)檢測MMR基因突變情況。結(jié)果 該家系結(jié)直腸癌患者腫瘤組織MSI檢測均表現(xiàn)為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI-H)；腫瘤組織MMR家族中MLH1表達(dá)均為陰性；MLH1基因第一外顯子存在2個新的錯義突變位點c.264G>T、c.265G>T，其中c.265G>T突變導(dǎo)致MLH1基因蛋白質(zhì)翻譯在該位點提前終止。結(jié)論 回族Lynch綜合征家系存在MLH1基因突變，即存在第一外顯子錯義突變位點c.265G>T。

Lynch綜合征；結(jié)直腸腫瘤；錯配修復(fù)基因；微衛(wèi)星不穩(wěn)定性；回族

Lynch綜合征為常染色體顯性遺傳疾病，發(fā)病率占所有結(jié)直腸癌的2%～3%[1]，其主要發(fā)病機(jī)制為錯配修復(fù)基因(MMR)突變導(dǎo)致的DNA錯配修復(fù)功能障礙。Lynch等[1]最早確定MMR基因為癌癥的易感基因，隨后越來越多的錯配修復(fù)家族基因被發(fā)現(xiàn)，目前報道的主要有MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2等[2]。我國對Lynch綜合征的研究起步較晚，針對少數(shù)民族家系的研究更少。本課題組在臨床工作中發(fā)現(xiàn)1個回族Lynch綜合征家系，現(xiàn)對該家系的基因情況進(jìn)行分析，探討其基因特點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 先證者(第4代，Ⅳ8)，男性，37歲，回族，腸鏡檢查見距肛門8～13 cm直腸左前壁有一菜花樣腫物。術(shù)后病理診斷為直腸低分化腺癌。本家系現(xiàn)存6代(均為回族)，共有結(jié)直腸癌患者14例，其中結(jié)腸癌12例，直腸癌3例(1例為直腸癌術(shù)后患結(jié)腸癌)。至2016年1月尚在世7例；結(jié)腸癌發(fā)病部位均為右半結(jié)腸，病理診斷為管狀腺癌或黏液腺癌，組織分化程度均較低，無原位癌。均行右端結(jié)腸切除術(shù)，術(shù)后均行常規(guī)化療。家系中存在3例患者互為1級親屬的現(xiàn)象。家族中連續(xù)3代均有發(fā)病。該家系符合Amsterdam標(biāo)準(zhǔn)。其中1例因年齡大、身體狀況極差未納入本研究，余6例患者的家系位置及臨床資料見表1。

表1 6例結(jié)直腸癌患者的基本資料

注：*為先證者；Ⅲ為第三代，Ⅳ為第四代。

1.2 外周血及腫瘤組織DNA提取 取本家系中6例患者及5例正常人的外周血，采用QIAGEN公司全血DNA提取試劑盒提取外周血DNA，置于-20 ℃冰箱保存。隨機(jī)選取其中3例患者(Ⅳ1、Ⅳ8、Ⅳ15)既往手術(shù)所取的腫瘤石蠟包埋組織，采用QIAGEN公司石蠟包埋組織DNA提取試劑盒提取DNA，置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 腫瘤組織微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)檢測 選取1.2所提DNA作為檢測樣本，采用直接測序法檢測DNA微衛(wèi)星標(biāo)記序列是否與UCSC數(shù)據(jù)庫人類基因組序列一致。依照美國國立癌癥研究所推薦的判定標(biāo)準(zhǔn)選取5個檢測位點，分別為BAT25、BAT26、D5S346、D2S123、D17S150。判定標(biāo)準(zhǔn)：≥2個位點不穩(wěn)定判定為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-H)，1個位點不穩(wěn)定判定為低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-L)，5個位點均穩(wěn)定判定為微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)。測序分析結(jié)果顯示，3例患者腫瘤組織DNA均表現(xiàn)為MSI-H。

1.4 腫瘤組織MMR表達(dá)檢測 取1.2中3例患者石蠟包埋腫瘤組織，并以遠(yuǎn)離腫瘤的切緣結(jié)腸組織(距腫瘤5 cm以上)作為對照，采用免疫組化法檢測腫瘤組織中MLH1、MSH2及MSH6表達(dá)。采用半定量評估法判定結(jié)果。對染色深度和陽性細(xì)胞百分率分別計分：無染色為0分，弱染色為1分，中等強(qiáng)染色為2分，強(qiáng)染色為3分；陽性細(xì)胞比例<1%為0分，1%～10%為1分，>10%～50%為2分，>50%～80%為3分，>80%為4分。染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率之和為0～2分為陰性，3～5分為陽性，6～7分為強(qiáng)陽性。結(jié)果顯示，3例患者腫瘤組織MLH1表達(dá)均陰性，MSH2及MSH6表達(dá)均陽性。

1.5 MMR突變檢測 1.3結(jié)果顯示3例患者腫瘤組織中MLH1基因表達(dá)均缺陷，故對MLH1基因19個外顯子進(jìn)行測序。選取家系先證者全血DNA為樣本，應(yīng)用Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用PCR反應(yīng)試劑盒對MLH1基因外顯子區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳并測序。測序結(jié)果對比采用SeqMan軟件。

該家系先證者外周血DNA在MLH1基因1號外顯子上發(fā)現(xiàn)有2個突變位點，分別為c.264G>T、c.265G>T，其余外顯子未發(fā)現(xiàn)突變。在NCBI SNP數(shù)據(jù)庫中未查到上述位點已知的SNP。根據(jù)突變序列翻譯出氨基酸序列在NCBI Protein Blast數(shù)據(jù)庫中與常見的幾種動物氨基酸進(jìn)行特異性對比，發(fā)現(xiàn)這些動物在該位點氨基酸序列與野生型一致，推測該位點所在序列可能為保守序列，即c.264G>T突變?yōu)橥x突變，不對氨基酸序列產(chǎn)生影響，而c.265G>T可導(dǎo)致MLH1基因序列翻譯在第22位提前終止。采用Polyphen進(jìn)行蛋白功能預(yù)測，預(yù)測結(jié)果顯示此突變?yōu)橛泻ν蛔?。推測c.265G>T突變由于提前終止氨基酸序列翻譯從而使蛋白質(zhì)功能喪失。

1.6 突變位點家系內(nèi)驗證 參照1.5方法再次檢測該家系內(nèi)5例患者及另外5例正常個體外周血MLH1基因1號外顯子突變情況，反應(yīng)體系及條件均同1.5。結(jié)果顯示，5例患者均存在c.265G>T突變，正常個體中4例未發(fā)現(xiàn)突變、1例發(fā)現(xiàn)相同突變。見圖1。

注：A為結(jié)直腸癌患者，B為正常人；箭頭所指為MLH1基因1號外顯子c.265G>T突變。

圖1 家系內(nèi)結(jié)直腸癌患者及正常人MLH1基因1號外顯子測序圖

2 討論

目前對Lynch綜合征主要依靠基因檢測結(jié)合臨床診斷[3，4]。2015年美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)指出，疑似Lynch綜合征患者均應(yīng)進(jìn)行MMR蛋白免疫組化檢測或MSI分析，若MMR蛋白缺失或MSI-H，則應(yīng)排除BRAF V600E突變和MLH1啟動子甲基化因素，而后進(jìn)行MMR基因種系突變檢測[5]。

微衛(wèi)星是指基因組內(nèi)短序列的重復(fù)單元，在DNA復(fù)制過程中易發(fā)生錯誤[6]。MSI檢測是目前Lynch綜合征的初篩手段之一[7]，對Lynch綜合征患者選擇化療方案和判斷預(yù)后亦有一定的指導(dǎo)意義[8]。研究表明，處于Ⅱ期MSI-H的Lynch綜合征患者不能從5-氟尿嘧啶輔助化療中獲益，該化療方案會降低患者的生活質(zhì)量[9]。

MLH1基因是Lynch綜合征中突變率最高的MMR基因[10]，定位于3p21.3～23，含有19個外顯子，編碼蛋白含756個氨基酸，通常與其他MMR基因組成復(fù)合體發(fā)揮作用[11]。李曉芬等[12]統(tǒng)計分析了國內(nèi)近年來報道的Lynch家系基因突變情況，在檢出MMR種系突變的141個Lynch綜合征家系中，MLH1種系突變75個(53.2%)。不同的MMR基因突變所表現(xiàn)的發(fā)病特點并不完全相同。Vasen等[13]研究表明，MSH2突變基因攜帶者罹患子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(61%)比MLH1突變基因攜帶者(42%)高。

我國是多民族國家，但針對少數(shù)民族Lynch綜合征的研究較少。珠珠等[11]研究了云南地區(qū)7個Lynch綜合征家系，7個家系均存在MMR基因缺失，其中3個漢族家系檢出已知致病突變，但在4個少數(shù)民族家系中未檢測出包括大片段缺失及基因重排在內(nèi)的致病突變；提示結(jié)直腸癌患者的MMR基因表達(dá)以及MMR基因突變可能存在民族差異。

本研究報道的Lynch綜合征家系包括6代，均為回族，先證者以結(jié)腸癌入院，既往有直腸癌病史，采集信息發(fā)現(xiàn)高度聚集的癌癥家族史，為明確診斷進(jìn)行MMR蛋白檢測，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織MLH1表達(dá)缺失，繼而對家系內(nèi)患者及部分未患病者進(jìn)行MMR蛋白及基因檢測，發(fā)現(xiàn)致病突變，即MLH1基因第一外顯子錯義突變位點c.265G>T。家系內(nèi)1例未患病成員基因序列存在與患者相同突變，該成員年齡較小(17歲)，推測為致病基因突變攜帶者，其患腫瘤風(fēng)險較高，應(yīng)密切監(jiān)測，定期體檢。本家系患者腫瘤組織DNA表現(xiàn)為MSI-H，為錯配修復(fù)功能缺陷導(dǎo)致基因在復(fù)制過程中的錯誤得不到有效修復(fù)，繼而在微衛(wèi)星位點上出現(xiàn)不同于野生型的表型。

總之，回族Lynch綜合征家系存在MLH1基因突變，即存在第一外顯子錯義突變位點c.265G>T；該發(fā)現(xiàn)為我國少數(shù)民族Lynch綜合征基因突變研究增加了新的數(shù)據(jù)支持。

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Pedigree analysis and gene mutation inspection of Lynch syndrome in Hui nationality

XIEPeng,RENJingli,WANGWenjie,HUJian′en,HUGuiming,WUHuifang,NIUHaiou

(1TheSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014,China)

Objective To investigate the expression and mutations of DNA mismatch repair (MMR) of Lynch syndrome in the members of a Chinese Hui family. Methods The propositus was male, 37 years old, the forth generation, Hui nationality, had rectal poorly differentiated adenocarcinoma. There were six generations existing (Hui nationality), and a total of 14 patients with colorectal cancer were found including 7 living cases. The peripheral blood and tumor tissue DNA was collected from 6 cases of patients and 5 healthy controls. The microsatellite instability (MSI) was detected through DNA sequencing, the expression of MMR protein was measured using immunohistochemistry, and MMR gene mutations was detected by PCR amplification. Results The MSI detection of tumor tissues in the family members demonstrated MSI-H. The immunohistochemistry showed that MLH1 protein was negative. Two new missense mutation sites (c.264G>T and c.265G>T) in the first exon of MLH1 gene were found in 6 patients and 1 normal individual, and c.264G>T mutation led to early termination of MLH1 protein translation on this site. Conclusion There is MLH1 mutation in Hui family with Lynch syndrome, that is the missense muntation site c.264G>T in the first exon of MLH1 gene.

Lynch syndrome; colorectal neoplasms; DNA mismatch repair; microsatellite instability; Hui nationality

河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃項目(201503099)。

解澎(1988-)，男，碩士在讀，研究方向為消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)病機(jī)制。E-mail: 18239980973@163.com

任景麗(1964-)女，副主任醫(yī)師，副教授，研究方向為消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)病機(jī)制。E-mail: jingliren123002@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.005

R735.3

A

1002-266X(2016)28-0016-03

2016-01-25)