任媛媛，雷靜，趙然，辛靈彪，蘇超，高星杰，楊潔

(天津醫(yī)科大學(xué),天津300070)

·論著·

人SND1基因慢病毒載體構(gòu)建及穩(wěn)定表達(dá)SND1蛋白的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株篩選

任媛媛，雷靜，趙然，辛靈彪，蘇超，高星杰，楊潔

(天津醫(yī)科大學(xué),天津300070)

目的 構(gòu)建人SND1基因慢病毒載體，篩選穩(wěn)定表達(dá)SND1蛋白的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株，為探討SND1基因?qū)β殉舶┑恼{(diào)控作用提供細(xì)胞系模型。方法 采用PCR法從pCMV-FLAG-SND1質(zhì)粒中擴(kuò)增FLAG-SND1基因片段，連接到慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒pLVX-IRES-Hyg中，獲得重組慢病毒載體pLVX-FLAG-SND1。以pLVX-FLAG-SND1瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h，采用Western blotting法檢測SND1蛋白表達(dá)量。pLVX-FLAG-SND1重組質(zhì)粒通過與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得攜帶FLAG-SND1的重組慢病毒。以慢病毒感染SKOV3細(xì)胞48 h，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入1 μg/mL 潮霉素B，篩選穩(wěn)定表達(dá)SND1蛋白的細(xì)胞株，采用Western blotting法檢測該細(xì)胞株內(nèi)SND1蛋白表達(dá)量。結(jié)果 重組慢病毒載體經(jīng)雙酶切和基因測序比對鑒定正確。重組慢病毒載體在瞬時轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中SND1蛋白表達(dá)量高于野生型SKOV3細(xì)胞(P<0.01)。SKOV3細(xì)胞經(jīng)慢病毒感染、藥物篩選后獲得的穩(wěn)定表達(dá)株中SND1蛋白表達(dá)量高于野生型SKOV3細(xì)胞(P<0.01)。結(jié)論 成功構(gòu)建了SND1基因慢病毒載體pLVX-FLAG-SND1，并篩選出穩(wěn)定表達(dá)SND1蛋白的SKOV3細(xì)胞株，為進(jìn)一步明確卵巢癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

SND1基因；慢病毒載體；SKOV3細(xì)胞；卵巢癌

人類SND1蛋白又稱p100或Tudor-SN，是一種在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)、偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄調(diào)控和剪接的多功能蛋白，參與基因轉(zhuǎn)錄、RNA干擾、pre-mRNA剪切等多種生物學(xué)過程，在細(xì)胞增殖、凋亡、應(yīng)激及脂肪代謝等多種生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[1～4]。SND1蛋白在乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮促癌作用，其過表達(dá)可能是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因[5～7]。但SND1與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系尚不明確。2015年8～12月，本研究構(gòu)建了SND1基因慢病毒載體，包裝病毒后感染并篩選穩(wěn)定表達(dá)SND1蛋白的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株，為進(jìn)一步探討SND1在卵巢癌中的作用提供體外細(xì)胞系模型?，F(xiàn)將研究過程及結(jié)果報告如下。

1 材料、方法與結(jié)果

1.1 材料 人卵巢癌SKOV3、293T細(xì)胞系、pCMV-FLAG-SND1質(zhì)粒均為本實驗室保存。慢病毒載體質(zhì)粒pLVX-IRES-Hyg、包裝質(zhì)粒1和包裝質(zhì)粒2由天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系石磊教授饋贈。大腸桿菌DH5α感受態(tài)、Trans2K PlusⅡ DNA Marker、Trans 15K DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。氨芐青霉素和潮霉素B購自羅氏公司。轉(zhuǎn)染試劑Polyethyleneimine購自Sigma公司。DreamTaqGreen PCR Master Mix(2X)、Xba1和Not1限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自Fermentas公司。引物合成和基因測序均由上海Invitrogen公司完成。小量DNA快速回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司。質(zhì)?？焖傩√嵩噭┖匈徸员本┧魅R寶科技有限公司。去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)mega公司。鼠源SND1單克隆抗體由本實驗室制備。鼠源FLAG M2抗體購自Sigma公司。辣根過氧化氫酶標(biāo)抗鼠IgG購自KPL公司。BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Pierce公司。ECL Western blotting試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 潮霉素B最低致死濃度測定 將SKOV3細(xì)胞按3×105/孔接種于24孔板，用含10% FBS的McCOY 5A培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h，分別加入0、0.5、1、1.25、1.5 μg/mL 潮霉素B培養(yǎng)3天，結(jié)果顯示加入1、1.25、1.5 μg/mL潮霉素B的全培養(yǎng)基培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞全部死亡，加入0.5 μg/mL潮霉素B的全培養(yǎng)基培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞部分死亡，由此確定潮霉素 B對SKOV3細(xì)胞的最低致死濃度為1 μg/mL，后續(xù)研究選擇1 μg/mL 潮霉素 B進(jìn)行抗藥篩選。

1.3 重組慢病毒載體pLVX-FLAG-SND1的構(gòu)建與鑒定 設(shè)計FLAG-SND1基因的PCR引物，在兩條引物中分別引入Xba1、Not1限制性酶切位點。上游引物為5′-GCTCTAGAATGGATTACAAGGATGACG-ACG-3′，下游引物為5′-TTGCGGCCGCTTAGCGGCTGTAGCCAAATT-3′。PCR反應(yīng)體系參照說明書，退火溫度為60 ℃，從pCMV-FLAG-SND1質(zhì)粒中克隆完整的FLAG-SND1片段，所得PCR產(chǎn)物大小為2 798 bp。PCR產(chǎn)物及pLVX-IRES-Hyg慢病毒載體同時采用Xba1、Not1雙酶切，電泳后回收純化線性的酶切產(chǎn)物。用T4 DNA連接酶將線性化的慢病毒載體與FLAG-SND1片段進(jìn)行16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，在具有氨芐青霉素抗性的LB平板上篩選出16個陽性單克隆，編號1～16，進(jìn)行菌落PCR鑒定，并挑取鑒定陽性的單克隆搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，采用去內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒(按試劑盒說明書操作)；采用FLAG-SND1引物進(jìn)行質(zhì)粒PCR，PCR產(chǎn)物大小為2 798 bp。采用Xba1、Not1雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，兩條條帶分子量分別在9 000 bp和3 000 bp左右為初步鑒定正確的質(zhì)粒；若顯示一條條帶則為未切開或未連接成功的質(zhì)粒。將雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序，進(jìn)一步鑒定插入序列的準(zhǔn)確性。

電泳結(jié)果顯示，第3、4、8、11、12、13、16條帶位于3 000 bp左右，大小與預(yù)期相符，證明轉(zhuǎn)化成功，見圖1。選取3、4、8、11、12、13號單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行Xba1和Not1雙酶切，電泳結(jié)果顯示8、11、12、13號菌液提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切得到兩條條帶，分別在9 000 bp左右和3 000 bp左右，初步鑒定質(zhì)粒正確；4號菌液提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切僅顯示一條9 000 bp左右的條帶，說明未連接成功；3號菌液提取質(zhì)粒電泳結(jié)果條帶不明顯，質(zhì)粒抽提失??；見圖2。隨機(jī)選取8、11號菌液提取質(zhì)粒，采用FLAG-SND1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳條帶均位于3 000 bp左右，與預(yù)期相符，見圖3。重組質(zhì)?；驕y序結(jié)果經(jīng)序列比鑒定正確，證實FLAG-SND1序列已正確插入pLVX-IRES-Hyg質(zhì)粒，重組載體構(gòu)建完成。

注：M為Trans2K PlusⅡ DNA Marker；1～16分別為1～16號陽性單克隆菌落PCR產(chǎn)物；+為陽性對照。

圖1 重組質(zhì)粒菌落電泳圖

1.4 重組慢病毒載體SND1蛋白表達(dá)檢測 常規(guī)傳代培養(yǎng)293T細(xì)胞，待細(xì)胞生長至60%左右匯合，在轉(zhuǎn)染試劑Polyethyleneimine介導(dǎo)下用8、11、12、13號陽性單克隆菌落重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集蛋白，采用Western blotting法檢測SND1蛋白表達(dá)量，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。野生型293T細(xì)胞作為空白對照，瞬時轉(zhuǎn)染pCMV-FLAG-SND1質(zhì)粒的293T細(xì)胞作為陽性對照。以空白對照野生型293T細(xì)胞SND1蛋白表達(dá)量為1，8、11、12、13號重組質(zhì)粒SND1蛋白的相對表達(dá)量分別為15.91±0.84、15.50±0.95、16.27±0.61、15.43±0.10，陽性對照細(xì)胞的相對表達(dá)量為18.66±1.31；重組質(zhì)粒及陽性對照細(xì)胞SND1蛋白的相對表達(dá)量均較空白對照細(xì)胞明顯增加(P均<0.01)；說明重組質(zhì)粒LVX-FLAG-SND1在293T細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染成功。

注：M為Trans15K DNA Marker；VEC/-為環(huán)狀pLVX-IRES-Hyg載體；VEC/+為Not1/Xba1雙酶切后的線性pLVX-IRES-Hyg載體；3/-、4/-、8/-、11/-、12/-、13/-分別為3、4、8、11、12、13號陽性單克隆菌落提取的環(huán)狀pLVX-FLAG-SND1重組質(zhì)粒；3/+、4/+、8/+、11/+、12/+、13/+分別為Not1/Xba1雙酶切后的線性pLVX-FLAG-SND1重組質(zhì)粒。

圖2 重組質(zhì)粒Not1、Xbal雙酶切產(chǎn)物電泳圖

注：M為Trans2K PlusⅡ DNA Marker；8/質(zhì)粒、11/質(zhì)粒分別為8、11號陽性單克隆菌落pLVX-FLAG-SND1重組質(zhì)粒；8/PCR產(chǎn)物、11/PCR產(chǎn)物分別為 8、11號陽性單克隆菌落pLVX-FLAG-SND1重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物。

圖3 重組質(zhì)粒電泳圖

1.5 慢病毒質(zhì)粒包裝 轉(zhuǎn)染前一天將293T細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將去內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒制備的重組質(zhì)粒(或空載質(zhì)粒)與包裝質(zhì)粒1、包裝質(zhì)粒2按照22.5 μg：7.9 μg：14.6 μg體系比在500 μL opti-MEM中混勻，另用500 μL opti-MEM與100 μL轉(zhuǎn)染試劑Polyethyleneimine混勻。將混有質(zhì)粒的opti-MEM加入至混有Polyethyleneimine的opti-MEM中，輕彈混勻，室溫靜置5～20 min，逐滴緩慢加入到70%～80%匯合率的293T細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h，收集病毒上清至離心管，4 ℃保存。更換新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，再收集病毒上清至離心管中，4 ℃下500 g離心10 min，用0.45 μm的濾器過濾，-80 ℃長期保存用于感染。

1.6 SKOV3細(xì)胞感染、穩(wěn)定株篩選及鑒定 將SKOV3細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)使其融合率達(dá)60%左右；培養(yǎng)第2天棄上清，分別加入第8、11號pLVX-FLAG-SND1表達(dá)載體包裝病毒液2 mL，補(bǔ)加200 μL FBS和12 μg polybrene，感染24 h；采用新鮮的完全培養(yǎng)基代替含polybrene的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，加入1 μg/mL潮霉素B進(jìn)行篩選。篩選過程中以不加慢病毒、只加1 μg/mL潮霉素 B的SKOV3細(xì)胞作為對照，此皿細(xì)胞全部死亡即篩選完成。篩選出的SKOV3細(xì)胞能夠持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)FLAG-SND1，即為SKOV3慢病毒穩(wěn)定株。將一部分穩(wěn)定株凍存保種；剩余的細(xì)胞制備成細(xì)胞裂解液，采用Western blotting法檢測SND1蛋白表達(dá)量。以野生型SKOV3細(xì)胞作為空白對照，以pCMV-FLAG-SND1質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞作為陽性對照；以空白對照細(xì)胞SND1蛋白表達(dá)量為1，8、11號重組質(zhì)粒的相對表達(dá)量分別為9.62±0.40、9.96±0.89，陽性對照細(xì)胞的相對表達(dá)量為12.07±1.50；8、11號重組質(zhì)粒及陽性對照細(xì)胞的相對表達(dá)量均較空白對照細(xì)胞明顯增加(P均<0.01)；證明穩(wěn)定表達(dá)SND1蛋白的SKOV3細(xì)胞株構(gòu)建成功。

2 討論

SND1蛋白是一種在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)的多功能蛋白，具有高度同源性，其分子量為100 kDa，因此又稱為p100蛋白。1995年，SND1作為EB病毒核蛋白2(EBNA2)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活因子被首次發(fā)現(xiàn)并鑒定[8]。1997年，Callebaut等[9]發(fā)現(xiàn)人類Tudor-SN蛋白N端為由4個重復(fù)葡萄球菌核酸酶樣(SN-like)的SN(1～4)結(jié)構(gòu)域，C端為Tudor-SN5(TSN)結(jié)構(gòu)域，因此又被稱為Tudor-SN蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，SND1作為轉(zhuǎn)錄共激活因子借助結(jié)構(gòu)域與STAT6、c-Myb、STAT5等蛋白結(jié)合，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，促進(jìn)結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。本課題組前期研究解析了SND1蛋白N端TSN結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)，并且證實SND1不僅參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，還可以促進(jìn)剪接體裝配和pre-mRNA剪接加工過程。另外，SND1通過參與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)組成來調(diào)節(jié)RISC活性，從而影響微小RNA(miRNA)介導(dǎo)的靶mRNA沉默[10]； SND1作為細(xì)胞內(nèi)的一種多功能蛋白，在多種信號通路中發(fā)揮重要作用，參與細(xì)胞的生長、發(fā)育和癌變等過程。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SND1在肝癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，但其參與不同腫瘤發(fā)生的具體機(jī)制有所不同。在大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)小鼠SND1，細(xì)胞間接觸抑制消失并且細(xì)胞增殖加快[11]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SND1蛋白作為RISC組成成分之一，在人類結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，結(jié)腸癌細(xì)胞系中SND1通過影響RISC活性下調(diào)結(jié)腸腺瘤樣息肉(APC)蛋白的表達(dá)[12]。此外，在結(jié)腸癌組織中SND1及異黏蛋白(MTDH)的相互作用與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[13]。在肝癌細(xì)胞中SND1通過調(diào)節(jié)NF-κB誘導(dǎo)激活miR-221進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成[7]。在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中，SND1通過調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP3)的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。SND1協(xié)調(diào)剪接因子Sam68調(diào)控CD44基因的可變剪接，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖[14]。Ho等[15]在乳腺癌轉(zhuǎn)移模型的組織芯片中發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)，SND1表達(dá)亦呈上升趨勢。SND1的表達(dá)受TGF-β信號通路的調(diào)控，通過上調(diào)HECT類泛素連接酶smurf-1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[11]。但是，目前對卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制缺乏足夠的認(rèn)識。

慢病毒載體是以HIV-1病毒為基礎(chǔ)改造的病毒載體系統(tǒng)，對于一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，使用慢病毒載體能高效地將外源目的基因穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞的基因組中，從而實現(xiàn)目的基因穩(wěn)定持久性表達(dá)的目的。與真核表達(dá)質(zhì)粒相比，重組慢病毒技術(shù)的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性顯著提高。本課題組前期研究構(gòu)建的真核表達(dá)載體pCMV-FLAG-SND1在人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中轉(zhuǎn)染效率低。為了提高基因轉(zhuǎn)染效率，本研究選擇將FLAG-SND1基因插入慢病毒表達(dá)載體pLVX-IRES-Hyg，構(gòu)建重組慢病毒載體pLVX-FLAG-SND1，與慢病毒包裝質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒包裝。用包裝好的慢病毒顆粒感染SKOV3細(xì)胞，經(jīng)過潮霉素B抗性篩選，建立SKOV3慢病毒穩(wěn)定株，且慢病毒毒粒感染后的SKOV3細(xì)胞中SND1穩(wěn)定高表達(dá)，提示已成功運用該載體將SND1基因整合入SKOV3細(xì)胞的基因組中。SND1蛋白穩(wěn)定表達(dá)的SKOV3細(xì)胞株的獲得，為從細(xì)胞與分子水平上探討SND1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞的調(diào)控作用及機(jī)制提供了體外細(xì)胞系模型，為進(jìn)一步明確卵巢癌形成、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，并為卵巢癌的治療提供了新的分子靶標(biāo)。

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Construction of human SND1 lentivirus vector and its application in screening human ovarian cancer cell line SKOV3 for stable expression

RENYuanyuan,LEIJing,ZHAORan,XINLingbiao,SUChao,GAOXingjie,YANGJie

(TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Objective To construct the lentivirus vector of human SND1 gene and to screen the human ovarian cancer cell line SKOV3 which can stably expresses SND1 protein. Methods The fragment of FLAG-SND1 was cloned from pCMV-FLAG-SND1 plasmid, and then was inserted into lentivirus vector pLVX-IRES-Hyg. The lentivirus expression vector pLVX-FLAG-SND1 was established and was transiently transfected into 293T cells for 48 h. Western blotting was employed to determine SND1 expression. Then the lentivirus expression vector was co-transfected into 293T cells with packaging plasmids to obtain the recombinant lentivirus carrying FLAG-SND1. The lentivirus was collected to infect SKOV3 cells. After 48 h of infection, 1 μg/mL hygromycin B was used to screen the infected cells, so as to obtain a cell line with stable expression of SND1 protein. The expression level of SND1 was detected by Western blotting. Results Double restriction enzyme digestion and DNA sequencing demonstrated the lentivirus expression vector pLVX-FLAG-SND1 was constructed. The recombinant plasmids were transiently transfected into 293T cells, and the expression level was significantly higher than that of the wild-type SKOV3 cells (P<0.01). In the SKOV3 cells which stably expressed SND1 after infection and drug screening, the expression of SND1 was significantly higher than that of the wild-type SKOV3 cells (P<0.01). Conclusion The SND1 gene lentivirus vector pLVX-FLAG-SND1 is constructed successfully and we screen the SKOV3 cell line stably overexpressing SND1 via lentivirus system.

SND1 gene; lentivirus vector; SKOV3 cells; ovarian carcinoma

國家杰出青年基金資助項目(31125012)；教育部“創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃”(IRT13085)；國家自然科學(xué)基金資助項目(31370749/31571380)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃青年基金項目(15JCQNJC09900)。

任媛媛(1984-)，女，助理實驗師，研究方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: happyxinyuren@126.com

楊潔(1968-)，女，教授，研究方向為細(xì)胞因子及其信號傳導(dǎo)通路。E-mail: yangj@tijmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.001

Q591.2；Q784

A

1002-266X(2016)28-0001-04

2016-02-26)