李多，趙文月，齊維娟，高會(huì)斌，白文元

(1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口075000；2 河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院)

胃癌組織Hp檢測(cè)、SOX2蛋白表達(dá)變化及意義

李多1，趙文月1，齊維娟1，高會(huì)斌1，白文元2

(1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口075000；2 河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院)

目的 探討幽門螺旋桿菌(Hp)感染和性別決定相關(guān)基因簇2(SOX2)在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法 選擇慢性萎縮性胃炎患者40例(慢性萎縮性胃炎組)、萎縮性胃炎伴腸化生或不典型增生患者40例(不典型增生組)、胃癌患者50例(胃癌組)，采用13C呼氣試驗(yàn)和吉姆薩染色法檢測(cè)各組Hp感染情況，采用免疫組化法檢測(cè)各組SOX2蛋白表達(dá)情況，分析Hp感染及SOX2蛋白表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 胃癌組、不典型增生組Hp陽性例數(shù)明顯高于慢性萎縮性胃炎組(P均<0.05)，SOX2陽性表達(dá)例數(shù)明顯低于慢性萎縮性胃炎組(P均<0.05)，且胃癌組SOX2陽性表達(dá)例數(shù)低于不典型增生組(P<0.05)，胃癌組、不典型增生組Hp陽性例數(shù)比較P>0.05。Hp陽性與胃癌患者腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、臨床分期、組織分化程度均無關(guān)(P均>0.05)；SOX2陽性表達(dá)與胃癌臨床分期、浸潤(rùn)深度、組織分化程度有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑無關(guān)(P均>0.05)。胃癌組織Hp感染與SOX2陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.811，P<0.01)。結(jié)論 Hp感染和SOX2陽性表達(dá)增加均與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

胃癌；幽門螺旋桿菌；性別決定相關(guān)基因簇2

文獻(xiàn)報(bào)道，胃癌發(fā)病原因與幽門螺旋桿菌(Hp)感染、遺傳、環(huán)境、飲食等有關(guān)，其發(fā)病過程為正常胃黏膜→慢性萎縮性胃炎→胃黏膜不典型增生→胃癌[2，3]。干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子性別決定相關(guān)基因簇2(SOX2)是SRY-related HMG-box (SOX)家族的成員之一，參與胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)；在人類胃上皮細(xì)胞中可見SOX2表達(dá)，主要位于胃底和幽門黏膜，在結(jié)腸中不表達(dá)，故亦被稱為胃特異性轉(zhuǎn)錄因子[4]，控制胃蛋白酶和胃黏膜上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物MUC5AC的表達(dá)。由于SOX2在胃的胚胎發(fā)育、分化和維持正常胃表型和功能中具有重要作用，因此推測(cè)它可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但目前關(guān)于二者關(guān)系的報(bào)道較少[5]。為此，本研究觀察胃癌組織Hp感染情況及SOX2表達(dá)情況，并探討二者與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月～2015年1月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的慢性萎縮性胃炎患者40例(萎縮性胃炎組)、萎縮性胃炎伴腸化生或不典型增生患者40例(不典型增生組)、胃癌患者50例(胃癌組)，三組均經(jīng)胃鏡活檢和術(shù)后組織病理檢查明確診斷。其中萎縮性胃炎組男24例、女16例，年齡(60.32±9.73)歲；不典型增生組男19例、女21例，年齡(59.07±10.56)歲；胃癌組男32例、女18例，年齡(57.62±8.69)歲，腫瘤直徑≤5 cm 21例、>5 cm 29例，組織分化程度為高中分化14例、低分化36例，參照2001年國(guó)際抗癌聯(lián)合會(huì)修訂的分期標(biāo)準(zhǔn)，T1+T2期20例、T3+T4期30例。所有患者胃鏡檢查前4周均無抗Hp治療及服用非甾體抗炎藥物史。

1.2 Hp檢測(cè) ①13C呼氣試驗(yàn)。各組空腹6 h以上，收集呼出氣100 mL；口服13C-尿素，收集呼出氣100 mL；連接13C紅外線能譜儀檢測(cè)孔，自動(dòng)檢測(cè)。以測(cè)量值與基準(zhǔn)值的差值>2.5為陽性。②改良Giemsa染色。取活檢標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟，Giemsa染色30 min，純乙醇內(nèi)脫水，二甲苯透明，樹膠封固。在1 000倍油鏡下觀察Hp感染情況，Giemsa染色后Hp為紅色，呈“S”狀，分布在胃小凹和腺腔中。13C呼氣試驗(yàn)、改良Giemsa染色法同時(shí)陽性判定為Hp陽性，否則為陰性。

1.3 SOX2表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。取各組織石蠟切片，60 ℃烤片80 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫蠟，浸于檸檬酸鹽配制的修復(fù)液高溫高壓10 min進(jìn)行組織抗原修復(fù)，3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；滴加20 μL兔抗人SOX2多克隆抗體(1∶200)，將切片置于濕盒內(nèi)，4 ℃過夜，PBS沖洗3次；滴加生物素標(biāo)記的二抗50 μL，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗；滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液50 μL，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗；加入DAB 100 μL顯色，最后經(jīng)過蘇木素染色和鹽酸酒精分化后脫水封片，倒置顯微鏡下(200倍)拍照觀察。SOX2染色結(jié)果判定：SOX2陽性顆粒定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒。隨機(jī)觀察5～10個(gè)高倍鏡視野，記數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，陽性細(xì)胞百分比<5%記為0分，≥5%～<25%記為1分，≥25%～<50%記為2分，≥50%記為3分；著色呈淡黃色記為1分，黃色記為2分，棕黃色記為3分。陽性細(xì)胞百分比及著色強(qiáng)度評(píng)分乘積為0分記為陰性，1～3分記為弱陽性，4～6分記為中度陽性，7～9分記為強(qiáng)陽性；弱陽性、中度陽性、強(qiáng)陽性均記為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Person列聯(lián)系數(shù)法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Hp感染及胃組織SOX2表達(dá)比較 見表1。

表1 各組Hp感染及胃組織SOX2表達(dá)比較(例)

注：與萎縮性胃炎組比較，*P<0.05；與不典型增生組比較，#P<0.05。

2.2 Hp感染、SOX2陽性表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Hp感染與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、臨床分期、組織分化程度均無關(guān)(P均>0.05)。SOX2陽性表達(dá)與胃癌臨床分期、浸潤(rùn)深度、組織分化程度均有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑均無關(guān)(P均>0.05)。見表2。

2.3 胃癌組織Hp感染與SOX2表達(dá)的關(guān)系 胃癌患者Hp陽性者SOX2陽性表達(dá)2例(5.56%)，Hp陰性者SOX2陽性5例(35.71%)。經(jīng)過Person列聯(lián)系數(shù)法分析，胃癌組織Hp感染與SOX2陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.811，P<0.01)。

3 討論

胃癌是我國(guó)最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病涉及多個(gè)因素，如Hp感染、遺傳因素和環(huán)境因素等。 在慢性胃炎發(fā)展為胃癌的過程中， 眾多致病因子可能作用于胃癌的不同時(shí)期。國(guó)內(nèi)外研究表明，Hp感染與胃癌的發(fā)病有關(guān)，但其機(jī)制尚未完全明確。Hp感染后引起胃黏膜急慢性炎性反應(yīng)，細(xì)胞凋亡與增殖平衡紊亂，胃癌相關(guān)基因突變，引起端粒酶活性增加，誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞線粒體基因突變，促進(jìn)胃癌的發(fā)生[6]。

流行病學(xué)調(diào)查顯示，普通人群Hp感染率為40%～60%，Hp感染難以清除，多造成終身感染。有文獻(xiàn)報(bào)道，在慢性淺表性胃炎患者如伴發(fā)Hp感染可使泌酸腺萎縮，引起慢性萎縮性胃炎；感染持續(xù)存在可加重胃黏膜炎癥，引發(fā)潰瘍，最終可能導(dǎo)致胃癌的發(fā)生[7]。Hp感染引起胃黏膜炎癥，使細(xì)胞異常增殖[8]，并導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控蛋白異常表達(dá)[9]，可能是其導(dǎo)致癌變的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，胃黏膜中可以產(chǎn)生多種細(xì)菌毒力因子[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，萎縮性胃炎組、不典型增生組和胃癌組Hp感染率逐漸升高，說明Hp感染在慢性非萎縮性胃炎→萎縮性胃炎伴腸化生或不典型增生→胃癌演變過程中起重要作用。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Hp感染僅與胃癌患者腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)，與患者年齡、性別、腫瘤直徑、臨床分期及分化程度等因素?zé)o關(guān)，表明Hp感染可能促使慢性胃炎向胃癌的演變，但其具體機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步探索。

SOX基因是一類功能性很強(qiáng)的基因，位于染色體3q26.3-27，其編碼蛋白質(zhì)由317個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其氨基酸序列高度保守，在許多物種的睪丸和其他組織分化和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[11]。SOX基因參與胚胎早期發(fā)育，其中B族的SOX2基因報(bào)道較多[12]，其表達(dá)于早期神經(jīng)板和神經(jīng)管中，可作為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的標(biāo)志[13]，定點(diǎn)打靶產(chǎn)生的SOX2缺失純合子在胚胎植入前就會(huì)死亡[14]。此外，SOX2是決定胃黏膜上皮分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，控制胃黏膜上皮細(xì)胞的分化，調(diào)控胃分化標(biāo)志物的表達(dá)[15]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組SOX2陽性表達(dá)明顯低于非萎縮性胃炎和不典型增生組，而且在萎縮性胃炎伴腸化生或不典型增生組織中的陽性表達(dá)低于慢性非萎縮性胃炎組織。此外，SOX2陽性表達(dá)與胃癌患者臨床分期、浸潤(rùn)深度、組織分化程度有關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑無關(guān)。SOX2表達(dá)情況可作為胃癌診斷和判斷預(yù)后的指標(biāo)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，胃癌組織Hp感染與SOX2陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。推測(cè)Hp感染胃黏膜后通過氧化損傷產(chǎn)生大量細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子等誘發(fā)SOX2甲基化，使SOX2表達(dá)減少，部分胃組織出現(xiàn)不典型增生。

綜上所述，Hp感染以及SOX2陽性表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，檢測(cè)二者可為胃癌的診斷、治療和臨床監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

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2016-03-16)