程留奇，張中冕，王海莉，莊琰，李靜

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450000)

多西他賽聯(lián)合BEZ235對Kras基因突變的肺腺癌A549細胞凋亡的影響及機制

程留奇，張中冕，王海莉，莊琰，李靜

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450000)

目的 觀察多西他賽聯(lián)合BEZ235不同作用方式對Kras基因突變的A549細胞凋亡的影響，探討其作用機制。方法 體外培養(yǎng)Kras基因突變的人肺腺癌A549細胞，采用不同濃度多西他賽(2.5、5、10、20、40 μg/L)和BEZ235(1.25、2.5、5、10、20 μmol/L)干預(yù)24、48、72 h；MTT法檢測細胞增殖抑制率，確定BEZ235的最佳干預(yù)濃度為17.5 μmol/L、多西他賽的最佳干預(yù)濃度為15.3 μg/L，二者最佳干預(yù)時間均為48 h。另取人肺腺癌A549細胞，隨機分為對照組(耐藥組)、多西他賽單藥組、BEZ235單藥組、BEZ235同步多西他賽組(兩藥同時應(yīng)用)、多西他賽序貫BEZ235組(給予多西他賽24 h改用BEZ235 24 h)、BEZ235序貫多西他賽組(給予BEZ235 24 h改用多西他賽24 h)，均給予最佳干預(yù)時間及最佳干預(yù)濃度，采用流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率，Western blotting法檢測pAKT、pERK蛋白表達。結(jié)果 對照組、多西他賽單藥組、BEZ235單藥組、BEZ235同步多西他賽組、多西他賽序貫BEZ235組、BEZ235序貫多西他賽組A549細胞凋亡率逐漸升高(P均<0.05)，pAKT蛋白相對表達量逐漸降低(P均<0.05)。BEZ235單藥組pERK蛋白相對表達量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但均高于其他各組(P均<0.05)。結(jié)論 多西他賽和BEZ235不同聯(lián)合作用方式作用下均可促進Kras基因突變的A549細胞凋亡，以BEZ235序貫多西他賽效果最好；降低pAKT及pERK表達，協(xié)同抑制PI3K/AKT/mTOR和Raf/MEK/ERK通路可能是其作用機制。

肺癌；多西他賽；BEZ235；Kras基因； A549細胞

肺腺癌是肺癌的主要類型[1]，約20%的肺腺癌患者出現(xiàn)Kras基因突變[2]，這部分患者對多數(shù)靶向治療藥物不敏感[3]。Kras基因是ras基因家族的主要成員，人腫瘤細胞中Raf/MEK/ERK通路和PI3K/AKT/mTOR通路是ras信號傳導(dǎo)通路下游的兩條重要通路。多西他賽是目前肺腺癌的一線化療藥物，通過抑制細胞有絲分裂而發(fā)揮抗腫瘤作用。BEZ235是阻斷PI3K和mTOR的雙重靶向抑制劑。多西他賽可增強BEZ235對前列腺癌細胞的敏感性[4]，提示多西他賽可能對Raf/MEK/ERK通路有一定的抑制作用。2013年11月～2014年3月，本研究觀察了多西他賽聯(lián)合BEZ235不同作用方式對Kras基因突變的人肺腺癌A549細胞凋亡的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Kras基因突變的人肺腺癌A549細胞株，由鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院實驗室提供。BEZ235，購自上海翊圣生物科技有限公司；多西他賽，購自齊魯制藥有限公司。小鼠抗人p-AKT抗體、p-ERK抗體購自美國Santa Cruz公司。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；LAS4000型熒光圖像分析儀，購自日本FUJIFILM公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 取Kras基因突變的人肺腺癌A549細胞，置于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞呈單層貼壁生長，隔天傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 多西他賽、BEZ235最佳濃度確定 取對數(shù)生長期A549細胞，調(diào)整細胞密度為5×104/mL，接種于96孔板，每孔200 μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h；向96孔板加入藥物，多西他賽濃度設(shè)置為2.5、5、10、20、40 μg/L，BEZ235濃度設(shè)置為1.25、2.5、5、10、20 μmol/L。另設(shè)一個空白孔和一個對照孔，分別加入等量的RPMI 1640培養(yǎng)基。分別于藥物干預(yù)24、48、72 h時采用MTT法檢測細胞增殖抑制率，確定多西他賽最佳干預(yù)時間及最佳干預(yù)濃度。結(jié)果顯示，兩藥最佳干預(yù)時間均為48 h，多西他賽最佳干預(yù)濃度為15 μg/L、BEZ235為17.5 μmol/L。

1.4 細胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期A549細胞，調(diào)整細胞密度至5×104/mL，接種于96孔板，每孔200 μL，待細胞貼壁后，分為對照組(不加藥物)、多西他賽單藥組、BEZ235單藥組、BEZ235同步多西他賽組(兩藥同時應(yīng)用)、多西他賽序貫BEZ235組(給予多西他賽24 h改用BEZ235 24 h)、BEZ235序貫多西他賽組(給予BEZ235 24 h改用多西他賽24 h)。各組均采用1.3確定的最佳干預(yù)時間及干預(yù)濃度。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 pAKT、pERK蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取對數(shù)生長期A549細胞，調(diào)整細胞密度至5×104/mL，接種于96孔板，每孔200 μL。實驗分組及處理同1.4。各組培養(yǎng)48 h，采用RIPA蛋白裂解液收集各組細胞總蛋白，分別進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入1∶1 000稀釋的pAKT、pERK單克隆抗體及山羊抗鼠IgG雜交液(1∶5 000)。采用Image Quant LAS4000軟件掃描各組對應(yīng)條帶的灰度值，計算pAKT、pERK蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

對照組、多西他賽單藥組、BEZ235單藥組、BEZ235同步多西他賽組、多西他賽序貫BEZ235組、BEZ235序貫多西他賽組A549細胞凋亡率逐漸升高，pAKT蛋白相對表達量逐漸降低，各組間比較P均<0.05。BEZ235單藥組ERK蛋白相對表達量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但均高于其他各組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞凋亡率及pAKT、pERK蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與多西他賽單藥組比較，#P<0.05；與BEZ235單藥組比較，△P<0.05；與BEZ235同步多西他賽組比較，▲P<0.05；與多西他賽序貫BEZ235組比較，▽P<0.05。

3 討論

有研究證實，發(fā)生Kras基因突變的肺癌患者極少發(fā)生表皮生長因子受體(EGFR)突變或間變性淋巴瘤激酶(ALK)基因重組，因此應(yīng)用靶向藥物治療效果欠佳[6，7]。BEZ235是PI3K/mTOR雙靶點抑制劑，本課題組前期研究證實，BEZ235可抑制A549細胞AKT mRNA表達，但對Raf/MEK/MAPK通路并無明顯影響[8]。BEZ235單獨用于Kras基因突變的肺癌小鼠時效果欠佳，聯(lián)合MEK抑制劑效果較好。對于存在MEK抑制劑抵抗的肺癌及直腸癌細胞株，BEZ235聯(lián)合MEK抑制劑顯示出更好的療效。因此認為，Raf/MEK/ERK通路和PI3K/AKT/mTOR通路之間可能存在交互作用，PI3K級聯(lián)和Raf級聯(lián)在肺腺癌的進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9,10]，即使在PI3K級聯(lián)信號傳導(dǎo)受阻時，細胞仍可以通過Raf級聯(lián)調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生物學(xué)特性[11]。Yasumizu等[4]針對前列腺癌細胞的研究顯示，多西他賽可增強BEZ235的抗腫瘤作用，多西他賽可能同時對Raf/MEK/ERK通路及PI3K/AKT/mTOR通路有抑制作用。

本研究結(jié)果顯示，BEZ235及多西他賽均能促進A549細胞凋亡，兩藥聯(lián)合應(yīng)用促凋亡效果更明顯，且BEZ235序貫多西他賽組細胞凋亡率最高。AKT、ERK是PI3K/AKT/mTOR和Raf/MEK/ERK通路的關(guān)鍵因子，pAKT及pERK是二者的磷酸化(活化)形式。Western blotting結(jié)果顯示，相對于對照組，BEZ235可降低pAKT表達、對pERK表達并無影響，而多西他賽可同時降低pAKT及pERK表達，兩藥聯(lián)合相對于單藥可進一步降低pAKT及pERK表達；提示多西他賽能同時抑制PI3K/AKT/mTOR和Raf/MEK/ERK通路；BEZ235序貫多西他賽顯示出更好的抑制效果，原因可能為BEZ235可克服存在Kras基因突變的肺腺癌細胞對多西他賽治療的抵抗，提示BEZ235與多西他賽在抑制Kras基因下游信號傳導(dǎo)過程中具有協(xié)同作用。

綜上所述，多西他賽和BEZ235不同聯(lián)合作用方式下均可促進Kras基因突變的A549細胞凋亡，以BEZ235序貫多西他賽效果最好；降低pAKT及pERK表達，協(xié)同抑制PI3K/AKT/mTOR和Raf/MEK/ERK通路可能是上述結(jié)果產(chǎn)生的原因。

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