羅鋼，蔡麗英

(黃石市中心醫(yī)院 湖北省理工學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北黃石435000)

結(jié)締組織生長因子對人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及機制

羅鋼，蔡麗英

(黃石市中心醫(yī)院 湖北省理工學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北黃石435000)

目的 觀察結(jié)締組織生長因子(CTGF)對人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，探討其作用機制。方法 體外培養(yǎng)人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞，取傳代(第3代)細(xì)胞隨機分為CTGF組和對照組，CTGF組用含50 ng/mL CTGF的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，對照組僅用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h，采用實時熒光定量PCR法檢測兩組鈣黏素E(E-cadherin)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和Wnt信號通路相關(guān)基因β連環(huán)蛋白(β-catenin)、淋巴樣增強因子1(Lef1)、Wnt基因家族2B(Wnt2B)、糖原合成酶激酶3(GSK-3β)mRNA相對表達(dá)量，Western blotting法檢測E-cadherin和α-SMA蛋白相對表達(dá)量。結(jié)果 CTGF組β-catenin、Lef1、Wnt2B、GSK-3β mRNA相對表達(dá)量均高于對照組(P均<0.01)，E-cadherin、α-SMA mRNA及蛋白相對表達(dá)量均高于對照組(P均<0.01)。結(jié)論 CTGF可致人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化，激活Wnt信號通路可能是其作用機制。

人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞；結(jié)締組織生長因子；細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化；Wnt信號通路

青光眼為眼科常見病，其病因復(fù)雜，對視力危害極大，是致盲的主要原因[1]。青光眼濾過術(shù)是臨床治療青光眼的常用方法，通過建立房水外引流而降低眼壓，修復(fù)視功能[2]；但術(shù)后濾過區(qū)瘢痕形成常影響手術(shù)效果。研究表明，成纖維細(xì)胞異常黏附、增殖、間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化及細(xì)胞外基質(zhì)大量合成是導(dǎo)致青光眼濾過術(shù)后濾過區(qū)瘢痕形成的重要原因[3]。但人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞在病理情況下是否發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化鮮有報道。結(jié)締組織生長因子(CTGF)作為一種新的致纖維化生長因子，在轉(zhuǎn)化生長因子β下游發(fā)揮重要作用，是病理性纖維瘢痕化過程中的重要介質(zhì)[4,5]。2014年6月～2015年7月，本研究觀察了CTGF對人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞株來源于黃石市中心醫(yī)院眼科中心。DMEM培養(yǎng)基(高糖型)購自上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司，F(xiàn)BS購自南京安培化工科技有限公司，Wnt信號通路相關(guān)基因β連環(huán)蛋白(β-catenin)、淋巴樣增強因子1(Lef1)、Wnt基因家族2B(Wnt2B)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)多克隆抗體均購自美國Abcam公司，鈣黏素E(E-cadherin)抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，鼠抗人α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。TRIzol總RNA提取試劑盒購自美國Biomiga公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒均購自美國Fermentas公司。實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。CTGF購自美國Peprotech公司，采用0.1%牛血清白蛋白(BSA)液稀釋，稀釋濃度為50 ng/mL，分裝于EP管中，置于-20 ℃冰箱保存，實驗過程中根據(jù)所需質(zhì)量濃度用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋。

1.2 人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 將人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞置于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(高糖型)中，于5% CO2、恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)到80%，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代后每24 h更換1次培養(yǎng)液，每3天進(jìn)行1次傳代，取第3代細(xì)胞完成后續(xù)實驗。取傳代培養(yǎng)生長良好的細(xì)胞，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，按照密度為6×104/mL接種于96孔板。隨機分為CTGF組和對照組，CTGF組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入50 ng/mL的 CTGF，于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h；對照組僅在培養(yǎng)液中相同條件下培養(yǎng)48 h。

1.3 E-cadherin、α-SMA、β-catenin、Lef1、Wnt2B、GSK-3β mRNA表達(dá)檢測 采用實時熒光定量PCR法。取兩組貼壁培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，將培養(yǎng)液棄去，PBS沖洗3次，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞；采用TRIzol總RNA提取試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計測定總RNA純度，取A260/A280>1.80樣品完成后續(xù)實驗；采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板鏈cDNA；以cDNA為模板，采用PCR試劑盒完成擴增。相關(guān)基因引物均由上海生工公司設(shè)計合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、45 s，92 ℃、30 s，56 ℃、15 s，74 ℃、15 s ，連續(xù)38個循環(huán)。每個樣品均設(shè)置3個平行反應(yīng)復(fù)孔。以內(nèi)參GAPDH為對照，2-△△Ct法計算上述各基因mRNA的相對表達(dá)量。

表1 基因引物序列

1.4 E-cadherin和α-SMA蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取兩組貼壁培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，將培養(yǎng)液棄去，PBS沖洗3次，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞；采用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，并用BCA法檢測蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜；用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉60 min；TBST液進(jìn)行洗膜30 min；加入一抗 E-cadherin抗體(1∶500)或鼠抗人α-SMA 單克隆抗體(1∶200)，于4 ℃下過夜孵育；洗膜，加入1∶1 000稀釋的相應(yīng)二抗，室溫下孵育60 min。每個樣品均重復(fù)3次實驗，以β-actin為內(nèi)參，用Quantity One凝膠圖像分析軟件分析條帶灰度值，獲得E-cadherin和α-SMA蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

CTGF組β-catenin、Lef1、Wnt2B、GSK-3β mRNA相對表達(dá)量均高于對照組(P均<0.01)，見表2。CTGF組E-cadherin、α-SMA mRNA和蛋白相對表達(dá)量均高于對照組(P均<0.01)，見表3。

3 討論

術(shù)后濾過區(qū)瘢痕形成為青光眼濾過手術(shù)術(shù)后常見不良反應(yīng)，不利于患者術(shù)后視力恢復(fù)[6]。研究表明，瘢痕形成涉及多個過程，如細(xì)胞因子合成、釋放，成纖維細(xì)胞遷移、活化、增殖和轉(zhuǎn)化，細(xì)胞外基質(zhì)降解等[7]。CTGF為纖維化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的因子，在調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖、遷移、分化及細(xì)胞外基質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用[8]。Zhang等[9]將CTGF注射到濾過泡內(nèi)，觀察到濾過通道瘢痕形成速度顯著增加。亦有研究利用RNA干擾技術(shù)使人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞中CTGF基因沉默，觀察到細(xì)胞增殖能力被顯著抑制[10]。上述研究均提示，CTGF與青光眼濾過手術(shù)術(shù)后濾過區(qū)瘢痕形成關(guān)系密切。

表2 兩組β-catenin、Lef1、Wnt2B、GSK-3β mRNA相對表達(dá)量比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.01。

表3 兩組E-cadherin、α-SMA mRNA及蛋白相對表達(dá)量比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.01。

E-cadherin是上皮細(xì)胞標(biāo)志物，在正常間葉組織來源的成纖維細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，在維持細(xì)胞間黏附性、細(xì)胞極性及細(xì)胞間信息傳遞過程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)增加是間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化的最顯著特征。本研究CTGF組Tenon囊成纖維細(xì)胞中E-cadherin mRNA和蛋白相對表達(dá)量均高于對照組，提示CTGF可能促進(jìn)成纖維細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。α-SMA為肌動蛋白家族成員，表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞和肌性上皮細(xì)胞，是人眼成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的標(biāo)志物，其表達(dá)增加可加速細(xì)胞纖維化過程[12]。本研究CTGF組細(xì)胞中α-SMA mRNA和蛋白相對表達(dá)量均高于對照組，進(jìn)一步說明CTGF可促進(jìn)人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

Wnt信號通路不僅在維持人體正常生理過程中發(fā)揮重要作用，而且與細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程關(guān)系密切[13]。本研究CTGF組細(xì)胞中Wnt信號下游樞紐信號分子β-catenin、下游靶因子Lef1及Wnt配體Wnt2B相對表達(dá)量均高于對照組，而Wnt信號激活因子GSK-3β相對表達(dá)量則低于對照組，表明CTGF可能通過激活Wnt信號通路而促進(jìn)人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化；具體作用機制可能為在生理狀態(tài)下GSK-3β通過降解β-catenin而抑制Wnt信號活性[14]，CTGF通過抑制GSK-3β活性進(jìn)而導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量積累，并與胞核內(nèi)TCF/LEF結(jié)合而誘導(dǎo)Wnt信號通路激活，促進(jìn)成纖維細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化，E-cadherin大量表達(dá)，加速瘢痕形成。

綜上所述，CTGF可致人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化，激活Wnt信號通路可能是其作用機制。

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蔡麗英(E-mail: 2755229172@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.010

R775

A

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2015-11-04)