劉芳，王會英

(河北大學附屬醫(yī)院北院，河北保定071000)

瑞芬太尼后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及機制

劉芳，王會英

(河北大學附屬醫(yī)院北院，河北保定071000)

目的 觀察瑞芬太尼后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響，探討其作用機制。方法 將30只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和瑞芬太尼組，每組10只。模型組和瑞芬太尼組結扎左冠狀動脈再松開結扎線制備心肌缺血再灌注損傷模型，假手術組僅在左冠狀動脈下穿線不結扎。瑞芬太尼組于再灌注前10 min靜脈輸注瑞芬太尼10 μg/(kg·min)，假手術組和模型組靜脈輸注等量生理鹽水。再灌注后24 h，取結扎線同水平缺血區(qū)心肌組織，采用HE染色觀察心肌組織病理學改變，采用RT-PCR及Western blotting法檢測心肌組織脂肪酸合成酶(Fas)、Caspase-3、Bcl-2 mRNA及蛋白表達。結果 心肌缺血再灌注24 h時，假手術組心肌細胞排列規(guī)則，細胞邊界清楚、胞核完整；模型組心肌細胞排列紊亂、邊界不清晰，心肌纖維斷裂，部分胞核消失；瑞芬太尼組心肌細胞排列稍疏松、胞核溶解較少，損傷程度介于假手術組和模型組之間。瑞芬太尼組和模型組心肌組織Fas、Caspase-3 mRNA及蛋白相對表達量均高于假手術組，瑞芬太尼組均低于模型組，組間比較P均<0.05；瑞芬太尼組和模型組心肌組織Bcl-2 mRNA及蛋白相對表達量均低于假手術組，瑞芬太尼組高于模型組，組間比較P均<0.05。結論 瑞芬太尼后處理可減輕心肌缺血再灌注損傷，其作用機制可能與抑制Fas、Caspase-3表達，促進Bcl-2表達，抑制心肌細胞凋亡有關。

心肌缺血再灌注損傷；瑞芬太尼；脂肪酸合成酶；Caspase-3；Bcl-2；大鼠

心肌缺血再灌注損傷是心外科手術操作中常見的不良事件，其發(fā)生機制復雜，涉及諸多環(huán)節(jié)，心肌細胞凋亡可能是最為重要的環(huán)節(jié)[1，2]。研究表明，瑞芬太尼后處理有助于保護心肌，緩解心肌缺血再灌注損傷[3,4]，但其作用機制仍不明確。2015年3～8月，本研究觀察了瑞芬太尼后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性SD大鼠30只，體質量260～300 g，合格證號：SCXK(豫)：2014-003，由河南省實驗動物中心提供。瑞芬太尼購自宜昌人福藥業(yè)(批號：國藥準字H20030197)，脂肪酸合成酶(Fas)、Caspase-3、Bcl-2和β-肌動蛋白兔抗小鼠多克隆抗體及鼠抗兔辣根過氧化物酶標記二抗均購自美國Sigma公司；引物均由上海生工公司設計合成；TRIzol總RNA提取試劑盒購自美國ABI公司，逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒均購自美國Promega公司，ECL試劑盒和蛋白檢測試劑盒均購自上海經科化學科技有限公司；LightCycler480實時熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司，Image-Pro Plus圖像分析軟件由美國Media Cybernetics公司提供。

1.2 心肌缺血再灌注損傷模型制作及瑞芬太尼后處理 采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組、模型組和瑞芬太尼組，每組10只。三組均給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉過程中監(jiān)測體溫、心率、心電圖、動脈血氣。使用18G靜脈留置針進行環(huán)甲膜穿刺，并將其套管置入氣管，進行機械通氣，呼吸比1.5∶1，氧流量2 L/min，頻率60次/min，PETCO230～40 mmHg，SpO298%～100%。根據文獻[5]的方法構建心肌缺血再灌注損傷模型：于左胸壁3、4肋間距離胸骨左緣0.4～0.6 cm處鈍性分層開胸，將5-0絲線從左冠狀動脈前降支穿過。假手術組僅將結扎線從左冠狀動脈前降支穿過而不結扎，模型組和瑞芬太尼組結扎左冠狀動脈。以心電圖出現增寬、增高的QRS波或ST段抬高>0.2 mV判定為缺血模型構建成功。持續(xù)缺血達45 min時松開結扎線，將心電圖所示QRS波逐漸恢復正?；騍T段下降判定為再灌注模型構建成功。瑞芬太尼組于再灌注前10 min靜脈輸注瑞芬太尼10 μg/(kg·min)，假手術組和模型組靜脈輸注等量生理鹽水。再灌注后24 h將所有大鼠麻醉處死，取結扎線同水平缺血區(qū)心肌組織。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 心肌組織病理學變化 取部分心肌組織用生理鹽水洗凈，4%甲醛固定，制備心肌組織石蠟切片，常規(guī)HE染色，于高倍鏡下觀察心肌組織病理學改變。

1.3.2 心肌組織Fas、Caspase-3、Bcl-2 mRNA表達 采用熒光定量RT-PCR法。取三組心肌組織，研磨后分別加入細胞裂解液1 mL，采用TRIzol法提取心肌細胞總RNA，利用紫外分光光度計對樣品進行檢測，取A260/A280>1.80樣品進行后續(xù)操作。Fas引物：上游：5′-ATGGCTGTCCTGCCTCTGGT-3′，下游：5′-CACGAACGCTCCTCTTCAACTC-3′； Caspase-3引物：上游：5′-TCGAGGTCGACGGATTCGATG-3′，下游：5′-CCGCTCTAGAACTAGTGGATC-3′；Bcl-2引物：上游：5′-CTGGGAGAACAGGGTACGA-3′，下游：5′-ATGACCCCACCGAACTCAA-3′。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min、94 ℃變性60 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，36個循環(huán)。每個樣品均設置3個平行反應復孔。以β-actin為內參，采用2-△△Ct法計算心肌組織Fas、Caspase-3、Bcl-2 mRNA相對表達量。

1.3.3 心肌組織Fas、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達 采用Western blotting法。取三組心肌組織，采用蛋白裂解液提取心肌組織蛋白，測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品進行電泳、分離，轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，分別加入兔抗鼠Fas(1∶200)、Caspase-3(1∶500)或Bcl-2(1∶400)一抗及相應二抗，ECL發(fā)光試劑盒進行發(fā)光，采用Image-Pro Plus 圖像分析軟件對獲得的圖像進行分析，計算心肌組織Fas、Caspase-3、Bcl-2蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 心肌組織病理學變化 心肌缺血再灌注24 h，假手術組心肌細胞排列規(guī)則，細胞邊界清楚、胞核完整；模型組心肌細胞排列紊亂、邊界不清晰，心肌纖維斷裂，部分胞核消失；瑞芬太尼組心肌細胞排列稍疏松、胞核溶解較少，損傷程度介于假手術組和模型組之間。見插頁Ⅲ圖5。

2.2 心肌組織Fas、Caspase-3、Bcl-2 mRNA表達 見表1。

表1 三組心肌組織Fas、Caspase-3、Bcl-2 mRNA相對表達量比較±s)

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.3 心肌組織Fas、Caspase-3和Bcl-2蛋白表達 見表2。

表2 三組心肌組織Fas、Caspase-3、Bcl-2蛋白相對表達量比較±s)

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機制復雜，誘導心肌細胞凋亡是其發(fā)生機制之一[6～8]。發(fā)生缺血再灌注損傷時，細胞內GRP78表達上調，內質網應激增強，使C/EBP同源蛋白、c-Jun氨基末端激酶等促凋亡信號激活，加速細胞凋亡[9]。本研究心肌缺血再灌注24 h時三組心肌組織HE染色結果顯示，模型組心肌細胞排列紊亂、邊界不清晰、心肌纖維斷裂、部分胞核消失，提示心肌缺血再灌注損傷模型制備成功。

瑞芬太尼是最新的μ阿片受體激動劑，是臨床常用麻醉劑，具有藥效強、起效迅速、劑量容易控制、安全可靠等優(yōu)點。研究發(fā)現，缺血心肌在再灌注之前越早進行預處理越有利于改善心肌損傷。本研究參照文獻[10,11]報道結果，選取再灌注前10 min進行瑞芬太尼后處理，結果顯示瑞芬太尼組心肌細胞排列稍疏松、胞核溶解較少，損傷程度介于假手術組和模型組之間，證實瑞芬太尼后處理可減輕缺血再灌注損傷，與文獻[3,4]報道結果一致。

Fas/FasL系統(tǒng)在心肌缺血再灌注損傷誘導心肌細胞凋亡發(fā)生過程中發(fā)揮關鍵性作用[12]，Fas是一種細胞表面受體膜蛋白，其伸向細胞質的部分與TNF-α等受體同源，其配體與其結合后可引起Caspase級聯反應，導致表達Fas的細胞凋亡，這一過程被稱為死亡受體介導的凋亡路徑[13]。本研究結果顯示，瑞芬太尼組和模型組心肌組織中Fas mRNA和Fas蛋白相對表達量均高于假手術組，提示發(fā)生心肌缺血再灌注損傷時Fas基因被激活而大量表達，在心肌細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。Caspase-3作為Caspase家族重要成員，是凋亡的執(zhí)行蛋白，在凋亡過程中發(fā)揮關鍵性作用[14]。Bcl-2作為抗凋亡基因，可通過抑制線粒體中細胞色素C釋放而抑制細胞凋亡發(fā)生[15]。本研究顯示，心肌發(fā)生缺血再灌注損傷時Caspase-3表達上調，Bcl-2表達下調，從而使心肌細胞大量凋亡；瑞芬太尼后處理可抑制Fas和Caspase-3表達，促進Bcl-2表達，從而抑制心肌細胞凋亡的發(fā)生，對缺血再灌注過程中心肌細胞具有保護作用。

綜上所述，瑞芬太尼后處理可保護心肌細胞，減輕心肌缺血再灌注損傷，其作用機制可能與抑制Fas、Caspase-3表達，促進Bcl-2表達，從而抑制心肌細胞凋亡有關。

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王會英(E-mail: 240690712@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.013

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A

1002-266X(2016)28-0039-03

2015-10-23)