劉根賢，慕進勇，張守翠

(1.山東省日照市婦幼保健院檢驗科，山東日照 276826;2.山東省榮成市石島人民醫(yī)院檢驗科，

山東榮成 264309;3.山東省日照市中醫(yī)院骨科，山東日照 276800)

·臨床研究·

非小細胞肺癌患者胸水與外周血檢測EGFR基因突變的比較

劉根賢1，慕進勇2，張守翠3

(1.山東省日照市婦幼保健院檢驗科，山東日照 276826;2.山東省榮成市石島人民醫(yī)院檢驗科，

山東榮成 264309;3.山東省日照市中醫(yī)院骨科，山東日照 276800)

目的 比較外周血和胸水兩種樣本檢測EGFR基因突變的情況，為臨床選取合適的送檢標本提供參考。方法 選取非小細胞肺癌(NSCLC)合并惡性胸腔積液病例65例,收集血液和胸水標本，分別抽取DNA，使用巢式PCR擴增檢測。采用SPSS19.0軟件進行數據處理。結果 65例NSCLC患者中有吸煙史的患者占44.6%。病理類型為腺癌的有53例，占81.5%；非腺癌12例，占18.5%。NSCLC分期為Ⅲb者有34例，占52.3%；Ⅳ31例，占47.7%。胸水總檢出率(36.9%)高于血清總檢出率(18.5%)，兩種樣本中19號外顯子突變檢出率均高于21號外顯子的。19號外顯子的突變類型為刪除突變，即DelE746-A750、DelE746-T751，胸水中多出一種DelL747-P753 insS。21號外顯子的突變類型為點突變，即L858R和L861Q。結論 雖然外周血中的EGFR基因突變的檢出率低于胸水中的，但是19和21外顯子的突變情況在外周血和胸水標本中基本一致，循環(huán)DNA可以反映組織中DNA的變化。

非小細胞肺癌； 胸水； 外周血； EGFR基因突變

非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的80%，惡性程度高，發(fā)現時多數已經處于晚期。傳統(tǒng)的治療辦法，如化療、放療和手術的療效不盡如人意。隨著對肺癌生物標志物的深入研究和致病機理的逐步闡明，分子靶向治療已經成為肺癌綜合治療中的最新模式，受到廣泛關注。目前NSCLC治療的重要方向之一即以腫瘤細胞分化增殖相關的酶為靶點，其中以表皮生長因子受體(EGFR)為靶點的分子靶向治療取得了較廣泛的臨床應用。EGFR基因突變主要發(fā)生在18～21外顯子，其中19和21外顯子突變占據約90%。大量臨床研究顯示檢測EGFR基因突變可以篩查對靶向藥敏感的患者，從而實現靶向個體化治療[1-3]。但是EGFR基因突變樣本往往由組織取樣獲得，創(chuàng)傷大，操作繁瑣。近年來，NSCLC患者的外周血循環(huán)DNA分析可一定程度反映腫瘤情況，其檢測得到了廣泛關注[4]。胸水中可直接收集腫瘤脫落細胞，也是EGFR基因突變檢測的常見樣本來源[5]。本文比較了外周血和胸水兩種樣本檢測EGFR基因突變的情況，為臨床選取合適的送檢標本提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取NSCLC合并惡性胸腔積液病例65例，其中男35例，女30例，年齡37～79歲，平均年齡62歲。所有血液樣本均使用EDTA-K2真空采血管收集。采血后及時離心(3 500 r/min，10 min)分離血漿，取上清，獲得無血細胞成分的血漿，用1.5 mL離心管分裝。每例抽取胸水250～500 mL。

1.2 DNA抽提及巢式PCR擴增檢測

1.2.1 外周血樣本使用QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen)試劑盒抽提。胸水脫落細胞經石蠟包埋后，使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen)試劑盒抽提。抽提步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.2 巢式PCR擴增目的片段為EGFR基因19和21號外顯子。引物參照文獻設計[6]，引物合成及測序由上海生工生物工程公司完成。反應條件為：94 ℃，5 min;94 ℃，40 s、58 ℃，45 s、72 ℃，1 min；35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒DR01(北京艾德萊生物科技有限公司)。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行數據處理，計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 入選患者臨床資料 選取NSCLC合并惡性胸腔積液病例65例，男35例(陽性率71.4%)，女30例(陽性率28.6%)；年齡37～79歲，平均年齡62歲。有吸煙史的患者占44.6%。病理類型為腺癌的有53例，占81.5%；非腺癌12例，占18.5%。NSCLC分期為Ⅲb期有34例，占52.3%；Ⅳ期31例，占47.7%。

2.2 19和21外顯子突變檢出情況 65例NSCLC患者同時檢測血清樣本和胸水樣本中的EGFR基因突變情況，胸水總檢出率(36.9%)高于血清總檢出率(18.5%)，兩者相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩種樣本中19號外顯子突變檢出率均高于21號外顯子的。19號外顯子的突變類型為刪除突變，即DelE746-A750、DelE746-T751，胸水中多出一種，即DelL747-P753 insS。19號外顯子的突變類型為點突變，L858R、L861Q。

表1 目的基因及引物序列

表2 血清和胸水標本EGFR突變檢出情況比較

3 討 論

EGFR屬于受體酪氨酸激酶，存在于大部分正常上皮和部分間葉細胞，多種腫瘤組織中有過度表達，是腫瘤細胞增殖、浸潤轉移、血管生成等生物行為的重要調節(jié)因素。EGFR在正常肺組織中不表達或低表達，而在非小細胞肺癌中高表達，主要原因為過表達和基因擴增等，其表達與高分期、生存期縮短、淋巴結轉移等相關。病理狀態(tài)下，EGFR通路異常激活，EGFR酪氨酸激酶活性增強，下游信號通路隨之激活，細胞生長無法抑制，造成腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移等生物學特性得以強化。由于EGFR酪氨酸激酶是信號傳遞的必要條件之一，因而成為NSCLC治療的重要靶分子，阻斷EGFR信號傳遞通路可以抑制腫瘤生長，使細胞停留在G1期，誘導腫瘤細胞凋亡。EGFR基因突變導致細胞內酪氨酸激酶區(qū)改變，使得治療用藥(小分子酪氨酸激酶抑制劑)更容易結合，從而增加藥物的敏感性[7]。大量研究表明，酪氨酸激酶編碼區(qū)的基因突變主要是19外顯子的缺失和21外顯子的L858R點突變[8-10]。因此，檢測EGFR基因的19和21外顯子的突變情況可以從NSCLC患者中篩選出合適的治療對象進行有針對性的治療，有助于提高藥物療效。

本研究發(fā)現，外周血中19號外顯子的刪除突變是由于第2 236～2 250核苷酸缺失或者第2 236～2 253核苷酸缺失，分別導致746位谷氨酸至750位丙氨酸缺失(DelE746-A750)或者746位谷氨酸至751位蘇氨酸缺失(DelE746-T751)。胸水中19號外顯子還發(fā)現另外一種，即第2 240～2 257核苷酸缺失，導致747位亮氨酸至753位苯丙氨酸缺失，并插入絲氨酸(DelL747-P753 insS)。外周血和胸水中的21號外顯子突變情況相同，即第858位密碼子出現T/G轉換，導致編碼產物由亮氨酸變?yōu)榫彼?L858R)和第861位密碼子出現T/A轉換，導致編碼產物由亮氨酸變?yōu)楣劝滨０?L861Q)。

循環(huán)DNA來源于細胞凋亡(正常人群，長度185～200 bp)和細胞壞死(腫瘤患者，以長鏈DNA片段為主)。肺癌在演化的不同階段會伴隨特定基因的改變，這些改變了的DNA片段會進入循環(huán)中。因此循環(huán)DNA檢測對于腫瘤的早期診斷和預防有重要意義。大量研究表明，循環(huán)DNA與腫瘤組織DNA的基因變化一致性較好，因此，國內外學者嘗試對NSCLC外周血循環(huán)DNA分析發(fā)現腫瘤特異性標志物。為了尋找易獲得的標本進行EGFR基因突變檢測，近年來國內外研究者將注意力集中在了胸水和外周血上。惡性胸腔積液是晚期NSCLC患者的常見并發(fā)癥，采用胸水標本有操作風險小、檢出率高、與組織標本高度一致等優(yōu)點。但是對于NSCLC早期EGFR基因突變檢測，仍有待于進一步研究。外周血循環(huán)DNA是存在于血漿等體液中的游離DNA，NSCLC患者的腫瘤組織可通過細胞壞死、凋亡等方式釋放出，其含量與腫瘤的進展、治療及預后相關[2-3,11]。本研究對65例NSCLC患者的EGFR基因突變情況作一比較，發(fā)現外周血中的EGFR基因突變的檢出率低于胸水中的，差異有統(tǒng)計學意義。但是19和21外顯子的突變情況在外周血和胸水標本中基本一致，循環(huán)DNA可以反映組織中DNA的變化。隨著外周血循環(huán)DNA檢測技術的不斷進步，檢出率的不斷提升，將更加便于臨床的開展和實施，這將對肺癌患者的診斷、篩查、治療和隨訪有重要的意義，為臨床檢測提供方便有效的診斷方法，便于臨床的開展和實施，具有廣闊的應用前景。

[1]高云，陳嘉昌，朱振宇，等．基因突變及其檢測方法的研究進展[J]．分子診斷與治療雜志，2011，3(1)：51-56．

[2]姜北，李晶，鞏平．非小細胞肺癌患者血清EGFR基因突變循環(huán)DNA檢測[J]．中華腫瘤防治雜志，2014，21(1)：29-33．

[3]周小昀，李龍蕓，崔巍，等．檢測肺癌患者血清游離DNA的EGFR基因點突變與EGFR-TKI療效的相關性分析[J]．癌癥進展，2011，9(1)：13-18．

[4]王開云，熊敏，徐城林，等．非小細胞肺癌患者血清EGFR基因突變循環(huán)DNA檢測的臨床研究[J]．現代腫瘤醫(yī)學，2015，23(3)：332-334．

[5]Yeo CD,Kim JW,Kim KH,et al.Detection and comparison of EGFR mutations in matched tumor tissues,cell blocks,pleural effusions,and sera from patients with NSCLC with malignant pleural effusion,by PNA clamping and direct sequencing[J].Lung Cancer,2013,81(2):207-212.

[6]Lynch TJ,Bell DW,Sordella R,et al.Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib[J].N Engl J Med,2004,350(21):2129-2139.

[7]Li N,Li H,Su F,et al.Relationship between epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation and serum cyclooxygenase-2 Level,and the synergistic effect of celecoxib and gefitinib on EGFR expression in non-small cell lung cancer cells[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(80):9010-9020.

[8]Ono M,Kuwano M.Molecular mechanisms of epidermal growth factor receptor (EGFR) activation and response to gefitinib and other EGFR-targeting drugs[J].Clin Cancer Res,2006,12(24):7242-7251.

[9]Bar J,Onn A.Overcoming molecular mechanisms of resistance to first-generation epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors[J].Clin Lung Cancer,2012,13(4):267-279.

[10]Pallis A,Briasoulis E,Linardou H,et al.Mechanisms of resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in patients with advanced non-small-cell lung cancer:clinical and molecular considerations[J].Curr Med Chem,2011,18(11):1613-1628.

[11]Heitzer E.Ulz P,Geigl JB.Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer[J].Clin Chem,2015,61(1):112-123.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.051 文獻標識碼：A 文章編號：1673-4130(2016)07-0985-03

2015-10-24)