張廣清，戴洪法，葛晶晶，黃美瓊，劉玉線

(清遠市婦幼保健院，廣東清遠 511515)

·論 著·

肺炎支原體快速培養(yǎng)檢測法的臨床應用價值評估

張廣清，戴洪法，葛晶晶，黃美瓊，劉玉線

(清遠市婦幼保健院，廣東清遠 511515)

目的 探討6 h快速檢測法、PCR檢測法、血清抗體檢測法在肺炎支原體(MP)診斷中的價值。方法 選擇2012年8月至2014年8月呼吸科收治的140例患者作為研究對象，收集患者入院次日咽拭子進行快速鑒定培養(yǎng)基檢測；抽取患者靜脈血2 mL，采用ELISA法檢測患者MP特異性抗體；取MP快速培養(yǎng)基，對MP基因片段進行PCR擴增。結(jié)果 140例患者中共有43例咽拭子培養(yǎng)呈陽性，其中男25例，女18例，年齡2個月至14歲，其中肺炎24例，急性支氣管炎9例，慢性肺部疾病10例。MP快速培養(yǎng)法檢出陽性率為30.7%(43/140)，PCR檢測法檢出陽性率為45.0%(63/140)，PCR檢測法檢出陽性率顯著高于MP快速培養(yǎng)法(χ2=4.347,P=0.037)；兩種方法一致性檢驗，kappa=0.554(t=6.868,P=0.000)；MP特異性抗體檢出陽性率為37.9%(53/140)，MP快速培養(yǎng)法與特異性抗體檢測陽性檢出率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.150,P=0.284)；兩種方法一致性檢驗，kappa=0.338(t=4.050,P=0.000)。結(jié)論 MP 6 h快速檢測法用時短、操作簡單，但是依然存在假陽性的可能，將其作為MP診斷指標可能存在一定誤差。

肺炎支原體； 快速檢測； 酶聯(lián)免疫吸附法； PCR檢測法

肺炎支原體(M.pneumoniae,MP)是一種介于病毒和細菌之間的微生物[1-2]，也是呼吸系統(tǒng)感染常見的病原菌。臨床調(diào)查顯示近年來MP感染呈顯著上升趨勢[3]，其發(fā)病率約占肺炎的15%以上，以嬰幼兒最為常見。一直以來血清學檢測被認為是診斷MP感染最可靠的手段[4]，然而肺炎支原體IgG于血清IgM之后出現(xiàn)，且持續(xù)時間較長，即使診斷出IgG陽性也并非代表MP現(xiàn)癥感染[5]，因此其僅在回顧性分析及流行病學調(diào)查中有臨床價值。PCR檢測法具有較高的靈敏度，但是對技術和硬件要求較高，難以在基層推廣。MP 6 h快速培養(yǎng)法是近年來國內(nèi)開發(fā)出的新型MP檢測方法，其操作簡單、準確率高，受到廣大臨床醫(yī)生的青睞。本研究對MP 6 h快速培養(yǎng)法、PCR檢測法、血清抗體檢測法的應用進行比較，旨在探討MP快速培養(yǎng)法對MP感染的診斷價值，現(xiàn)將研究成果總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年8月至2014年8月兒科收治的140例患者作為研究對象，男72例，女68例,年齡2個月至14歲，其中慢性肺部疾病者43例，急性支氣管炎38例，肺炎59例。本研究均取得患者本人同意后簽署知情同意書，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 MP 6 h快速培養(yǎng)法 取無菌試子1支，規(guī)范足量采集患者咽后部、扁桃體部位的分泌物或痰液，置于培養(yǎng)瓶中，在瓶內(nèi)旋轉(zhuǎn)數(shù)圈充分混勻后蓋上瓶塞，并放入37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)6 h后讀取培養(yǎng)基顏色。判定標準[6]：培養(yǎng)6 h后培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色為陽性，培養(yǎng)基顏色無變化為陰性。使用試劑來源于武漢菁華時間科技有限公司。

1.2.2 PCR檢測法 痰標本由專人于入院24 h之內(nèi)用一次性導管鼻腔送入5～8 cm，利于負壓吸引的原理，吸取鼻咽分泌物1～2 mL，標本采用實時熒光PCR法檢測MP-DNA，操作按標準嚴格執(zhí)行，儀器來源于美國ABI-PCR擴增儀，使用試劑來源于深圳亞能生物有限公司。

1.2.3 MP特異性抗體IgM、IgG檢測 患兒與入院當天急性期或恢復期分別采集非抗凝靜脈血2 mL，2次采血間隔時間為1周，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測患者MP-IgM、IgG抗體，試劑盒來源于德國歐蒙醫(yī)學實驗診斷股份公司(ELISA法)，嚴格按照試劑盒說明書的操作流程規(guī)范操作。判定標準：比值<0.8結(jié)果陰性、1.1>比值≥0.8結(jié)果可疑、比值≥1.1結(jié)果陽性(比值=對照或患者樣本的吸光度值/標準品的吸光度值)。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行檢驗，計數(shù)資料以率的形式表示，率的比較采用χ2檢驗，一致性采用kappa檢驗，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般情況 140例患者中共有43例6 h快速培養(yǎng)呈陽性，其中男25例，女18例，年齡2～14歲，其中臨床診斷肺炎24例、急性支氣管炎9例、慢性肺部疾病10例。

2.2 MP 6 h快速培養(yǎng)法與PCR檢測法比較 MP 6 h快速培養(yǎng)法檢出陽性率為30.7%(43/140)，PCR檢測法檢出陽性率為45.0%(63/140)，PCR檢測法檢出陽性率顯著高于MP快速培養(yǎng)法(χ2=4.347,P=0.037)；兩種方法一致性檢驗，kappa=0.554(t=6.868,P=0.000)，兩種方法一致性不高，見表1。

表1 MP快速培養(yǎng)法與PCR檢測法比較(n)

2.3 MP 6 h快速培養(yǎng)法與MP特異性抗體檢測比較 MP快速培養(yǎng)法檢出陽性率為30.7%(43/140)，MP特異性抗體檢出陽性率為37.9%(53/140)，兩種方法陽性檢出率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.150,P=0.284)；兩種方法一致性檢驗，kappa=0.338(t=4.050,P=0.000)，兩種方法一致性亦不高，見表2。

表2 MP快速培養(yǎng)法與特異性抗體檢測比較(n)

3 討 論

MP感染常無特異性，好發(fā)于兒童和青少年。通常情況下MP感染經(jīng)過門診治療后即可痊愈，然而對于老年或兒童，嚴重MP感染常表現(xiàn)出嚴重心內(nèi)膜炎或腎炎[7-8]。因此，準確診斷MP感染對臨床治療具有重要指導意義。目前臨床對于MP感染診斷方法包括血清特異性抗體檢測、PCR檢測、MP快速分離培養(yǎng)、冷凝集試驗等；其中最常用的方法是血清抗體檢測。一般MP感染后常于1周出現(xiàn)相應臨床癥狀，此時IgM被檢出，至20 d左右達高峰，25周后消失。然而IgG常出現(xiàn)較晚，且持續(xù)時間長，即使臨床檢測IgG抗體陽性也并非代表出現(xiàn)MP現(xiàn)癥感染，因此只限于回顧性分析或流行病學調(diào)查，對臨床治療價值較小。Li[9]報道證實MP-IgM在發(fā)病10 d左右陽性檢出率最高，對MP早期診斷較為困難。另外，部分免疫系統(tǒng)缺陷的人群難以產(chǎn)生正常免疫應答，即使發(fā)生MP感染也難以產(chǎn)生抗體，導致臨床MP檢出率偏低[10-11]。

隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，許多病原體核酸的檢測方法得以建立，其中多聚酶鏈式反應(PCR)應用最為廣泛。PCR通過體外DNA擴增技術將微量DNA樣品迅速擴增百萬倍，從而進行序列測定。利用PCR技術可以檢測MP的16sRNA、P1蛋白等，其具有較高的敏感度和特異性，檢測時間快，還能有效避免交叉反應，被認為是MP感染診斷的發(fā)展趨勢。目前PCR主要用于衣原體、支原體等生長緩慢或培養(yǎng)困難的病原體鑒定。國外一項報道對血清學、PCR診斷MP感染進行比較[12]，結(jié)果顯示PCR最高靈敏、可靠。然而PCR需要專業(yè)的儀器、操作繁瑣，在現(xiàn)階段難以在基層醫(yī)院推廣，這也是其應用受到限制的客觀原因。

MP快速培養(yǎng)檢測技術是通過人工液體作為培養(yǎng)介質(zhì)，主要由MP生長、繁殖所必須的營養(yǎng)物質(zhì)和抑制其他細菌生長的抗菌藥物組成，因此對MP的特異性較強。MP快速培養(yǎng)的工作原理是當MP在培養(yǎng)基內(nèi)生長后，培養(yǎng)基內(nèi)pH值會降低，導致培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)辄S色。目前臨床上大量報道均證實MP快速培養(yǎng)對MP診斷的價值。周燕[13]報道稱快速培養(yǎng)法與血清特異性抗體檢測的一致性較高，這與本研究結(jié)論不符。本研究中MP快速培養(yǎng)法檢出陽性率為30.7%，顯著低于PCR檢測法(45.0%)，與MP特異性抗體檢出陽性率(37.9%)相比差異無統(tǒng)計學意義。其中MP快速培養(yǎng)法與PCR檢測法、MP特異性抗體法檢測一致性都偏低，說明MP快速培養(yǎng)法作為診斷MP感染指標仍值得商榷。邱素清[14]報道稱快速培養(yǎng)中可能存在真菌生長，導致培養(yǎng)基pH值降低，顏色也隨之變化，進而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。此外，本組中選擇的人群包括成人、兒童和老年，在不同年齡組中培養(yǎng)基pH值、抗菌藥物用量是否存在差異依然不明確。這最少提示不同年齡組用MP快速檢測法檢測結(jié)果可能會出現(xiàn)偏倚。Ratliff[15]亦證實兒童MP感染者中約有30%培養(yǎng)基存在真菌污染的可能性。另外，支氣管肺炎、呼吸道感染患者中同時伴有肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鏈球菌等細菌感染，上述細菌在培養(yǎng)基中生長也會導致假陽性的可能。因此，在MP快速培養(yǎng)基鑒定時，培養(yǎng)基的制備方法、抗菌藥物用量等還需要進一步改進。

綜上所述，MP快速檢測法用時短、操作簡單，但是依然存在假陽性的可能，將其作為MP診斷指標可能存在一定誤差。MP快速鑒定培養(yǎng)基需要對抗真菌及其他細菌感染方面進行技術改進，以避免對結(jié)果造成的影響。

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Evaluation of clinical application value of rapid culture and detection method of Mycoplasma pneumoniae

ZhangGuangqing,DaiHongfa,GeJingjing,HuangMeiqiong,LiuYuxian

(QingyuanMunicipalMaternalandChildHealthCareHospital,Qingyuan,Guangdong511515,China)

Objective To explore the value of Mycoplasma pneumoniae(MP) 6 h rapid detection method,PCR detection method and serum antibody detection method in diagnosis of MP.Methods A total of 140 patients admitted in the respiration department of our hospital from August 2012 to August 2014 were selected as the research subjects.The throat swab on the next d of admission was collected for conducting the rapid identification medium detection; 2mL of vein blood was extracted from the patients for detecting MP specific antibody by the ELISA method; the MP fast medium was taken for conducting the amplification of MP gene fragment by PCR.Results Among 140 cases,43 cases of throat swab cultures were positive,included 25 male cases and18 female cases; the age ranged 2?14 years old,in which 24 cases were pneumonia,9 cases were acute bronchitis and 10 cases were chronic lung diseases.The positive rate in the MP rapid culture method was 30.7%(43/140),which in the PCR detection method was 45% (63/140),the PCR detection method was significantly higher than the MP rapid culture method (χ2=4.347,P=0.037); in the consistency test of the two methods,kappa=0.554 (t=6.868,P=0.000); the positive detection rate of MP specific antibody was 37.9% (53/140),which had no statistical difference between the MP rapid culture method and the specific antibody detection (χ2=1.150,P=0.284); in the consistency test of two methods,kappa=0.338(t=4.050,P=0.000).Conclusion The MP 6 h rapid detection method has the advantages of short time and simple operation,but there is still the possibility of false positive,so certain errors may exist with which as the MP diagnostic index.

mycoplasma pneumoniae; rapid detection; ELISA; PCR assay

張廣清，男，副主任技師，主要從事臨床微生物及免疫學檢驗研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.009 文獻標識碼：A 文章編號：1673-4130(2016)07-0890-03

2015-11-15)