周玲玉，徐 彩，王樂琴，魏思宇，盧 蕾，練雪梅

(1.重慶醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院,營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室,重慶 400016；

2.重慶醫(yī)科大學脂質(zhì)研究中心,重慶 400016)

·論 著·

β-谷甾醇對人肺癌A549細胞增殖及凋亡的影響*

周玲玉1,2，徐 彩1,2，王樂琴1,2，魏思宇1，2，盧 蕾1，2，練雪梅△

(1.重慶醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院,營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室,重慶 400016；

2.重慶醫(yī)科大學脂質(zhì)研究中心,重慶 400016)

目的 研究β-谷甾醇對A549細胞是否具有潛在的抗增殖和誘導凋亡作用。方法 不同濃度β-谷甾醇處理人肺癌A549細胞24h后，采用CCK-8法檢測細胞的增殖抑制作用；流式細胞術檢測A549 細胞周期分布及凋亡率的變化。結(jié)果 β-谷甾醇以劑量依賴性方式明顯抑制A549細胞的生長；流式結(jié)果表明β-谷甾醇使A549 細胞阻滯在G2/M 期，同時促使A549細胞凋亡率的增加。結(jié)論 β-谷甾醇可誘導人肺腺癌A549細胞G2/M期細胞周期阻滯，并引起細胞凋亡性死亡。

β-谷甾醇； 肺癌； A549； 細胞周期； 細胞凋亡

肺癌是嚴重威脅人類生命健康的疾病，最新統(tǒng)計資料顯示，肺癌是引起全球癌癥死亡的首要原因[1-2]，其中非小細胞肺癌(NSCLC)，包括腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌，占所有肺癌的80%[3]。肺癌已成為我國增幅最快、最常見的惡性腫瘤，中國癌癥控制計劃已將肺癌的防治列為重點。盡管目前治療方法較多，但肺癌的治療效果卻始終令人不滿意，其5年生存率仍然較低[4]。更多的治療方法正在被探索之中，以便提高肺癌5年生存率和治療效果。目前通過蔬菜、水果、香料、茶葉、草本植物和藥用植物中的植物化學物來控制癌癥的發(fā)生發(fā)展已經(jīng)成為最可行的方法。植物化學物是植物次生代謝物，由于它對慢性疾病包括癌癥有潛在的預防作用而受到廣泛關注。植物甾醇是一種與膽固醇結(jié)構(gòu)相似的植物化學物，能夠取代腸道低密度脂蛋白(LDL)膽固醇。堅果、花生、芝麻、大豆、未精煉的植物油和谷物都是植物甾醇的豐富來源[5]。常見的膳食植物甾醇有β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇，分別占50%～65%、10%～40% 和0%～35%。

研究顯示，β-谷甾醇攝入量的多少與許多人類慢性病的發(fā)生率有關。目前研究證明，β-谷甾醇在降低血液膽甾醇含量、抑制腫瘤、防治前列腺肥大、抑制乳腺增生和調(diào)節(jié)免疫方面都有重要作用[6]。大量研究表明，β-谷甾醇作為潛在的天然藥物，能有效預防多種腫瘤的發(fā)生和生長，以往的研究主要集中于β-谷甾醇抗乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等方面，但對肺癌作用的報道很少，故本研究以人肺癌A549細胞為研究對象，對β-谷甾醇抗肺癌作用進行了初步探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人肺腺癌細胞株A549購于ATCC。

1.2 儀器與試劑 酶標儀(HIMFD，Gene Company Limited)；超凈工作臺(SW-CJ-2F，蘇州工業(yè)園三興凈化技術有限公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Eppendorf，CO170S-230-0000)；倒置熒光顯微鏡(leica，DMI-4000B)；生物安全柜(CMC，1384)。β-谷甾醇(Sigma，S9889-10 mg)；RPMI 1640(Hyclone，SH3080001B)；PBS磷酸鹽緩沖液(Hyclone，SH3025601B)；青鏈霉素混合液(Hyclone，CC0113)；二甲基亞砜DMSO(sigma,D2650)；小牛血清(GIBCO，16010-159)；0.25%胰蛋白酶(Hyclone，SH30042.01)；Cell Counting Kit-8(日本同仁化學，CK04)；RT-PCR引物序列(華大科技)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) A549細胞系培養(yǎng)于含10%小牛血清、1%雙抗(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，在37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞呈貼壁生長，3～4d傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3.2 細胞毒性檢測 細胞毒性效應用CCK-8試劑盒檢測。取對數(shù)生長期細胞，加細胞懸液(1×105cell/mL)100 μL每孔至96孔板(邊緣用滅菌PBS填充)，每組設置6個副孔。培養(yǎng)過夜，更換無血清培養(yǎng)基。饑餓12 h之后更換含β-谷甾醇(0、5、10、20、40 μmol/L)的培養(yǎng)基，同時設置空白對照組，培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)1～4 h，酶標儀測定450 nm波長各孔的吸光度。實驗重復3次。細胞活力%=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.3.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 取對數(shù)生長期細胞，加細胞懸液(2×105cell/mL)1 mL每孔至6孔板，每組設置3個副孔，培養(yǎng)過夜，更換無血清培養(yǎng)基。饑餓12 h之后，用不同濃度β-谷甾醇(0、2.5、10、40 μM)處理24 h。細胞用不含EDTA的胰酶消化后，用PBS洗滌2遍，1 000 r/min離心5 min，加1 mL PBS重懸送流式細胞室進行細胞凋亡率檢測。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞周期 取對數(shù)生長期細胞，加細胞懸液(2×105cell/mL)1 mL每孔至6孔板，每組設置3個副孔，培養(yǎng)過夜，更換無血清培養(yǎng)基。饑餓12 h之后，用不同濃度β-谷甾醇(0、2.5、10、40 μM)處理24 h。細胞用胰蛋白酶消化之后，再用預冷PBS洗滌細胞兩次，加1 mL -20 ℃ 70%的乙醇溶液重懸，4 ℃固定過夜。后送流式細胞室進行細胞周期檢測。

2 結(jié) 果

2.1 β-谷甾醇對A549細胞毒性的影響 CCK-8試劑盒檢測A549細胞活性。β-谷甾醇處理A549細胞24 h后，顯著抑制細胞增殖，且隨著藥物濃度的增加，其抑制作用逐步增強，呈明顯的劑量-效應關系。與對照組相比，β-谷甾醇在5、10、20、40 μM劑量作用下的細胞活力分別為(67.82±5.43)%、(53.87±8.46)%、(50.03±3.26)%和(36.96±6.53)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

*：P<0.05，**：P<0.01，與對照組比較。

圖1 β-谷甾醇對A549細胞的細胞毒性作用

2.2 β-谷甾醇對A549細胞周期的影響 流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果顯示，與對照組相比，2.5、10、40 μM β-谷甾醇實驗組處理A549細胞24 h后，G2/M期細胞比例由對照組的(4.41±1.21)%增加至(5.58±2.30)%、(5.58±2.09)%、(9.60±1.74)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)果說明β-谷甾醇誘導G2/M期細胞周期的阻滯，見圖2。

2.3 β-谷甾醇對A549細胞凋亡的影響 流式Annexin-V/PI雙染檢測細胞凋亡率，結(jié)果如圖3所示，0、2.5、10、40 μM β-谷甾醇實驗組細胞凋亡率分別為(13.61±2.29)%、(16.15±3.02)%、(26.04±2.18)%、(49.72±1.83)%，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此，β-谷甾醇可誘導A549細胞凋亡且呈濃度依賴性。

圖2 β-谷甾醇對A549細胞周期的作用

圖3 β-谷甾醇對A549細胞凋亡的作用

3 討 論

β-谷甾醇抗癌作用的動物實驗表明，含有2%混合植物甾醇的飲食能抑制癌細胞的生長，減少腫瘤的大小，并降低結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌的發(fā)病率[7-10]。體外研究結(jié)果還表明，植物固醇，尤其是β-谷甾醇，對乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、骨髓瘤和胰腺癌等均有抑制增殖和誘導凋亡的作用[11-16]。細胞周期調(diào)控異常和細胞凋亡是腫瘤生長不受控制及惡性轉(zhuǎn)化的主要原因。β-谷甾醇對肺癌細胞的作用目前尚未見研究報道，故本文初步研究了β-谷甾醇對人肺癌細胞A549細胞增殖和凋亡的影響。

實驗結(jié)果顯示，不同濃度β-谷甾醇處理人肺癌A549細胞，細胞活性隨藥物濃度增加逐漸降低，從(67.82±5.43)%降至(36.96±6.53)%，表明β-谷甾醇對A549細胞具有明顯的生長抑制作用，且呈顯著的劑量依賴性。誘導腫瘤細胞周期阻滯以及引起細胞凋亡是天然藥物抗腫瘤活性的重要機制[17]。細胞周期中G1/S、G2/M、M 中后期在調(diào)控細胞周期進展中發(fā)揮重要作用,其中G2/M期能防止受損或未完成復制的DNA 進入有絲分裂，并停留在G2期來修復DNA，故G2/M 期阻滯對腫瘤細胞顯得尤為重要[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可誘導結(jié)腸癌、白血病、肝癌等腫瘤細胞發(fā)生G2/M期細胞周期的阻滯[19-21]。本研究流式細胞周期分析表明，在β-谷甾醇作用24 h后，G2/M期細胞百分比從(4.41±1.21)%增加到(9.6±1.74)%，說明A549細胞在G2/M期發(fā)生了阻滯。提示β-谷甾醇可通過誘導A549細胞周期阻滯從而抑制腫瘤細胞的增殖。

β-谷甾醇不僅能促使腫瘤細胞發(fā)生細胞周期阻滯，亦能誘導細胞程序性死亡，即細胞凋亡(APO)，它是多細胞生物體維持組織完整性和功能，以及消除受損或不需要細胞的一個關鍵作用機制[22]。癌細胞凋亡作為一種潛在的治療靶點近年來受到關注。癌細胞逃避細胞凋亡的過程中，細胞增殖率增加，最終導致腫瘤形成。凋亡失調(diào)與腫瘤的發(fā)生密切相關，在調(diào)亡機制上50%的腫瘤細胞存在缺陷。細胞凋亡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中主要起著負反饋調(diào)節(jié)作用，可以阻礙腫瘤細胞的迅速生長。凋亡過程主要由2個蛋白家族介導，即Bcl-2家族蛋白和caspase家族蛋白，并最終導致結(jié)構(gòu)蛋白消化，DNA降解及細胞吞噬。細胞發(fā)生凋亡主要通過兩個途徑實現(xiàn)[23]：一是由促凋亡和抗凋亡因子介導的線粒體凋亡通路，二是細胞表面死亡受體通路。本實驗通過流式凋亡率的檢測，表明β-谷甾醇在0～40 μM范圍內(nèi)，以劑量依賴方式促進A549細胞凋亡，β-谷甾醇濃度越高，A549細胞凋亡率越大，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

綜上所述，本研究初步證實，一定濃度的β-谷甾醇可通過阻滯肺癌A549細胞周期于G2/M 期來抑制細胞增殖，同時促進細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

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Effect of β-sitosterol on proliferation and apoptosis of lung cancer cell line A549*

ZhouLingyu，XuCai，WangLeqin，LianXuemei△

(ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To investigate whether β-sitosterol possesses anti-proliferation and apoptosis inductive effect in A549 cells.Methods A549 cells were treated with various concentrations of β-sitosterol for 24 h.The cell proliferation inhibiting effect was measured by using the CCK-8 assay.The apoptosis rate and cell cycle distribution of A549 cells were detected by the flow cytometry method( FCM) after the treatment of β-sitosterol.Results β-sitosterol inhibited the growth of A549 cells in dose dependent manner.The FCM analysis results showed thatβ-sitosterol arrested A549 cells at the stage G2/M of cell cycle,meanwhile promoted the increase of A549 cells apoptosis rate.Conclusion β-sitosterol can induce the apoptotic cell death and G2/M arrest of human lung cancer A549 cells.

β-sitosterol; lung cancer; A549; cell cycle; cell apoptosis

國家自然科學基金資助項目(81071907)；重慶自然科學基金資助項目(2011BB5128)；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃(10-0997)。

周玲玉，女，碩士，主要從事肺癌與脂代謝研究。

△，E-mail：793585732@qq.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.001 文獻標識碼：A 文章編號：1673-4130(2016)07-0865-03

2015-12-18)