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綠色糖單孢菌麥芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中的高效分泌表達(dá)*

0引言

【研究意義】α-淀粉酶不能切割α-1，6糖苷鍵，但可以跨越α-1，6糖苷鍵作用于分支鏈內(nèi)部的α-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生的水解產(chǎn)物一般為麥芽糖、少量葡萄糖以及一些寡糖[1-2]。α-淀粉酶廣泛應(yīng)用于食品加工、紡織和制藥行業(yè)[3-5]。麥芽糖α-淀粉酶是指能水解淀粉得到主要產(chǎn)物為麥芽糖和少量葡萄糖的一類酶的總稱，來(lái)源于綠色糖單孢菌的麥芽糖α-淀粉酶水解淀粉的產(chǎn)物中麥芽糖含量可達(dá)70%(文獻(xiàn)[6])，在麥芽糖漿和麥芽糖的工業(yè)生產(chǎn)上具有一定的應(yīng)用前景。【前人研究進(jìn)展】目前，應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)α-淀粉酶已經(jīng)非常成熟，但是也存在一定的不足，如自身代謝產(chǎn)生內(nèi)毒素、容易形成包涵體、產(chǎn)物分離純化工藝復(fù)雜等。而應(yīng)用枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主具有很多優(yōu)勢(shì)，例如枯草芽孢桿菌被GRAS認(rèn)定為安全級(jí)別的微生物、無(wú)明顯的密碼子偏好性、因蛋白分泌系統(tǒng)功能完善而具有很好的分泌能力等[7-8]，因此，枯草芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域[9-12]。Kim等[13]將來(lái)源于枯草芽孢桿菌SHU4-2的麥芽糖α-淀粉酶基因在Bacillus subtilis168中表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中出現(xiàn)淀粉、麥芽糖或者β-環(huán)糊精時(shí)，基因能夠表達(dá)，而當(dāng)存在葡萄糖、果糖或者蔗糖時(shí)，該基因不表達(dá)，說(shuō)明該基因可能受到代謝產(chǎn)物的反饋抑制。2009年訾楠等[14]從地衣芽孢桿菌ATCC14580中克隆到一個(gè)麥芽糖α-淀粉酶基因，并成功在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)；2011年轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中表達(dá)，生成的麥芽糖α-淀粉酶幾乎全部分泌到培養(yǎng)基中，采用HPLC檢測(cè)產(chǎn)物，結(jié)果表明該酶催化水解淀粉的主要產(chǎn)物為麥芽糖；對(duì)菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化后，最高酶活達(dá)到5.9 U/mL?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前研究的麥芽糖α-淀粉酶大多是在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)，也有在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行分泌表達(dá)，但是表達(dá)量不高，同時(shí)，鑒于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)存在的不足，因此有必要研究麥芽糖α-淀粉酶在枯草芽孢桿菌中的高效分泌表達(dá)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】克隆綠色糖單孢菌麥芽糖α-淀粉酶基因sva，并構(gòu)建重組質(zhì)粒pHCMCO4-Pglv-sva，使其在宿主B.subtilis 1A857中表達(dá)，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，期望得到高產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶的工程菌株。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

營(yíng)養(yǎng)缺陷型表達(dá)宿主枯草芽孢桿菌1A857(培養(yǎng)時(shí)需添加必需氨基酸leuA、metB和trpC)和pHCMCO4大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體均購(gòu)自BGSC；大腸桿菌Trans-10為本實(shí)驗(yàn)室保存；pSE-sva重組質(zhì)粒和pHCMCO4-Pglv表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.2主要酶和試劑

PrimerSTARHMHS DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶SacⅠ均購(gòu)自TaKaRa公司；DNA小量提取試劑盒、膠回收試劑盒和PCR純化試劑盒等購(gòu)自BioFlux博日公司。

1.1.3培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(W/V):胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%；枯草芽孢桿菌1A857生長(zhǎng)培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1.5%(W/V)，蛋白胨15 g/L，酵母抽提物25 g/L，氯化鈉10 g/L，(NH4)2SO420 g/L，另外再添加3種必需氨基酸leuA、metB、trpC，終濃度均為0.5%(W/V)。

1.2方法

1.2.1目的基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增pHCMCO4-Pglv表達(dá)載體，上游引物與下游引物各自含有與目的基因重疊的21個(gè)堿基(下劃線部分)，即

Plvse-up:CACGTCGGCGCTCGCGTATGAA-

TATTACTTAGAGGATACTATTGAGA；

Plvse-down:GTCGCGTTCGCCGGGTGGTGCTGCCGCCGCTGCTGCAGAAT。

設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增麥芽糖α-淀粉酶基因sva，即

Sva-up：GCACCACCCGGCGAACGCGA；

Sva-down：TCATACGCGAGCGCCGACGTG。

以pHCMCO4-Pglv表達(dá)載體為模板，PCR擴(kuò)增體系：5×PrimeSTAR buffer 10 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，Plvse-up 1 μL，Plvse-down 1 μL，template 1 μL，PrimeSTAR DNA Polymerase 0.5 μL，加ddH2O至50 μL。載體PCR退火溫度和延伸時(shí)間分別為68℃，7 min。以pSE-sva重組質(zhì)粒為模板，采用兩步法PCR擴(kuò)增目的基因，PCR體系：5×PrimeSTAR buffer 10 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，Sva-up 1 μL，Sva-down 1 μL，template 1 μL，PrimeSTAR DNA Polymerase 0.5 μL，加ddH2O至50 μL。退火和延伸同時(shí)進(jìn)行，溫度為68℃，時(shí)間為2 min。各取2.5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證PCR成功后用膠回收試劑盒回收目的條帶，并用瓊脂糖凝膠電泳分析驗(yàn)證回收目的片段的純度。

花椒精油中還含有大量的酯類化合物，其中含有的乙酸芳樟酯化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，常溫下不會(huì)變色，在皂用香精和高檔香料產(chǎn)品的制造中經(jīng)常會(huì)用到。精油中還有一些其他酯類化合物，比如乙酸松油酯，它是帶有類似檸檬、薰衣草清香，氣味有一些甜的物質(zhì)，其香氣停留時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，是我國(guó)頒布的《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》所允許使用的食品香料之一。此外，花椒精油中還含有乙酸異龍腦酯、乙酸香葉酯、乙酸-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環(huán)己酯等酯類化合物，它們均為花椒香味的主要來(lái)源之一。除此之外，這些酯類化合物在醫(yī)學(xué)上還具有鎮(zhèn)靜和止痙攣的治療功效[7]。

采用Clontech公司的In-fusion HD cloning kit 融合連接兩個(gè)目的片段，10 μL連接體系：5×In-fusion Enzyme Premix 2 μL，穿梭載體pHCMCO4-Pglv線性載體5 μL，sva 3 μL。將體系混勻置37℃恒溫水浴15 min，然后立即于50℃水浴15 min，冰上冷卻后轉(zhuǎn)化2.5 μL大腸桿菌Trans-10感受態(tài)細(xì)胞。取200 μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于帶有Amp抗性的LB平板上，再置于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落提質(zhì)粒進(jìn)行SacⅠ單酶切驗(yàn)證正確后送測(cè)序。1.2.2重組酶的表達(dá)及SDS-PAGE分析

將重組質(zhì)粒pHCMCO4-Pglv-sva轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌1A857進(jìn)行表達(dá)，并以空質(zhì)粒pHCMCO4-Pglv作為對(duì)照，分別以1%(V/V)的接種量轉(zhuǎn)接于100 mL的LB培養(yǎng)基中(含有17 μg/mL的氯霉素Cm)，37℃，220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)6 h后加入1.5%(W/V)麥芽糖誘導(dǎo)表達(dá)，從接種后開(kāi)始每隔12 h取樣，并用DNS[15]測(cè)定發(fā)酵液粗酶的酶活力。取麥芽糖誘導(dǎo)24 h的發(fā)酵液1 mL通過(guò)真空濃縮機(jī)濃縮至50 μL左右，與上樣緩沖液按照1∶1(V/V)混合處理后進(jìn)行10%(W/V)SDS-PAGE分析。

麥芽糖α-淀粉酶活力定義：在最適條件下，每分鐘生成1 μmoL葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位(1 U)。酶活力的計(jì)算公式為

其中，G為葡萄糖含量(mg/mL);n為稀釋倍數(shù)(mg/mL)；198.17為葡萄糖分子量；10為反應(yīng)時(shí)間(min)；0.01為酶液體積(mL)。

1.2.3重組菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.3.1最適葡萄糖濃度

首先挑取單菌落轉(zhuǎn)接于5 mL左右的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)活化菌種，于500 mL三角瓶中加入30 mL葡萄糖濃度(W/V)分別為0.5%，1.0%，1.5%的發(fā)酵培養(yǎng)基(加入Cm終濃度為50 μg/mL)，同時(shí)加入3%(V/V)過(guò)夜培養(yǎng)的菌種，培養(yǎng)至菌體OD600值約為0.6時(shí)加入1.5%(W/V)麥芽糖誘導(dǎo)表達(dá)。每間隔6 h分別取樣，在波長(zhǎng)λ=600 nm下，將菌液適當(dāng)稀釋后，測(cè)定其OD600值，同時(shí)取發(fā)酵液測(cè)定胞外粗酶活。從含有1.5%(W/V)的葡萄糖這一組發(fā)酵液中取樣，通過(guò)真空濃縮機(jī)濃縮至50 μL左右，與上樣緩沖液按照1∶1(V/V)混合處理后進(jìn)行10%(W/V)SDS-PAGE分析。

1.2.3.2最適氯霉素濃度

將重組菌株過(guò)夜活化后以3%(V/V)的接種量轉(zhuǎn)接入到含有氯霉素濃度分別為50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 h至菌體OD600值約為0.6時(shí)加入1.5%(W/V)麥芽糖，在35℃，200 r/min恒溫?fù)u床進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌液測(cè)定不同氯霉素濃度濃度下菌體的OD600值，并收集發(fā)酵液用DNS法測(cè)定粗酶的酶活力。

1.2.4重組菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.4.1單因素試驗(yàn)

(1)誘導(dǎo)溫度：將重組菌株過(guò)夜活化后以接種量為3%(V/V)接入到發(fā)酵培養(yǎng)基(Cm終濃度為200 μg/mL)中，培養(yǎng)6 h菌體OD600值約為6時(shí)加入1.5%麥芽糖誘導(dǎo)表達(dá)，分別放置25℃，30℃，35℃，40℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)66 h后用DNS法測(cè)定粗酶活力。

(2)接種量：將重組菌株過(guò)夜活化后以1%，2%，4%，8%的接種量(V/V)接入到含有200 μg/mL氯霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 h菌體OD600值約為6時(shí)加入1.5%麥芽糖在最適溫度條件下恒溫誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)66 h后收集發(fā)酵液用DNS法測(cè)定粗酶活力。(3)裝液量：將重組菌株過(guò)夜活化后以最適接種量轉(zhuǎn)接于分別含有30 mL、50 mL、70 mL、90 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(Cm終濃度為200 μg/mL)的500 mL三角瓶中，培養(yǎng)6 h菌體OD600值約為6時(shí)，加入1.5%麥芽糖在最適溫度條件下恒溫誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)66 h后收集發(fā)酵液用DNS法測(cè)定粗酶活力。

1.2.4.2正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇誘導(dǎo)溫度、接種量和裝液量進(jìn)行L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)計(jì)3個(gè)平行然后取平均值，按照表1進(jìn)行試驗(yàn)，從而確定最優(yōu)的發(fā)酵條件。

表1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Table 1The design of orthogonal test

因素Factor水平Level123裝液量Liquidvolume(A,mL)253035接種量Inoculumsize(B,%)345誘導(dǎo)溫度Inductiontemperature(C,℃)333537誤差Error(E)---

2結(jié)果與分析

2.1目的基因的擴(kuò)增和重組質(zhì)粒的構(gòu)建

如圖1所示，PCR擴(kuò)增得到大小約為1.4 kb和6.4 kb的兩個(gè)DNA片段，這與預(yù)期目的基因的大小一致。

M1:λDNA/HindⅢ DNA Maker;1:PCR product of pHCMCO4-Pglv；M2:W2003 DNA Marker; 2:PCR product of sva

圖1PCR產(chǎn)物分析

Fig.1Digestion of PCR products

如圖2所示，重組質(zhì)粒經(jīng)Sac Ⅰ單酶切后得到一條約為7.8 kb的條帶，與預(yù)期的大小一致，說(shuō)明目的片段已經(jīng)連接到載體pHCMCO4-Pglv上，重組質(zhì)粒pHCMCO4-Pglv-sva構(gòu)建成功。

M:λDNA/HindⅢ DNA Marker；1，3:pHCMCO4-Pglv-svarecombinant plasmid；2，4：pHCMCO4-Pglv-svarecombinant plasmid digested withSacⅠ

圖2重組質(zhì)粒酶切分析

Fig.2Digestion of the recombinant plasmids

2.2重組酶活力的測(cè)定和SDS-PAGE分析

如圖3所示，重組菌株在LB培養(yǎng)基中的酶活力隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在培養(yǎng)120 h時(shí)達(dá)到最高酶活力，約為24 U/mL。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，在55 kDa處出現(xiàn)一條蛋白條帶，與預(yù)期目標(biāo)蛋白大小相符(圖4)，推斷為綠色糖單孢菌麥芽糖α-淀粉酶。

圖3培養(yǎng)時(shí)間對(duì)重組酶活力的影響

Fig.3Effect of culture time on recombinant enzyme activity

M:Protein marker；1:Total soluble proteins of B.subtilis 1A857 containing plasmid pHCMCO4-Pglv-sva；2:Total soluble proteins of B.subtilis 1A857 containing plasmid pHCMCO4-Pglv

圖4重組酶的SDS-PAGE電泳分析

Fig.4SDS-PAGE analysis of recombinant enzyme

2.3重組菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1最適葡萄糖濃度

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，添加一定濃度的葡萄糖有助于營(yíng)養(yǎng)缺陷型枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)，但是葡萄糖濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生代謝物反饋抑制。由圖5和圖6可知，當(dāng)葡萄糖濃度為1.5%(W/V)時(shí)，菌體OD600值最大，約為27，酶活力也最高，達(dá)100 U/mL，均明顯高于葡萄糖濃度為0.5%和1.0%(W/V)時(shí)的菌體OD600值和粗酶活力。說(shuō)明1.5%(W/V)的葡萄糖濃度對(duì)重組菌產(chǎn)酶量的抑制作用還不是很明顯，主要是作為碳源供菌體生長(zhǎng)。此外，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，在55 kDa左右出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，與核酸序列理論推算的蛋白質(zhì)分子量相符(圖7)。

2.3.2最適氯霉素濃度

如圖8所示，重組酶活力和菌體生長(zhǎng)量均隨著氯霉素濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)氯霉素濃度為200 μg/mL時(shí)，最高酶活力達(dá)到272 U/mL；重組菌在氯霉素濃度為100 μg/mL時(shí)生長(zhǎng)最快。

圖5　葡萄糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

圖6葡萄糖濃度對(duì)重組酶活力的影響

Fig.6Effect of glucose concentrations on recombinant enzyme activity

M:Protein marker；1:Total soluble proteins of B.subtilis 1A857 containing plasmid pHCMCO4-Pglv-sva；2:Total soluble proteins of B.subtilis 1A857 containing plasmid pHCMCO4-Pglv

圖7重組酶的SDS-PAGE電泳分析

Fig.7SDS-PAGE analysis of recombinant enzyme

2.4重組菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1單因素試驗(yàn)

如圖9所示，重組菌的最適誘導(dǎo)溫度為35℃，此時(shí)酶活力最高可以達(dá)到224 U/mL。當(dāng)接種量為4%時(shí)酶活力最高，為265 U/mL，當(dāng)接種量過(guò)大時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗快，后期產(chǎn)酶的積累減少，接種量較少時(shí)，菌體積累量不夠，也影響產(chǎn)酶量的積累。裝液量間接反映溶氧量對(duì)菌株產(chǎn)酶量的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)裝液量為30 mL時(shí)，培養(yǎng)66 h可以達(dá)到最高酶活力257 U/mL，說(shuō)明重組菌對(duì)氧氣的需求量很大。

圖8不同氯霉素濃度下重組酶酶活力和菌體OD600

Fig.8The recombinant enzyme activity and OD600in different chloride concentration

圖9單因素試驗(yàn)結(jié)果

Fig.9Result of single factor experiment

2.4.2正交試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，最佳的發(fā)酵條件組合為A1B3C3，即最佳的發(fā)酵條件為裝液量25 mL、接種量5%、誘導(dǎo)溫度37℃，在此條件下，發(fā)酵液粗酶活力達(dá)到257.3698 U/mL(表2)。方差分析結(jié)果顯示，SA>SB>SC，說(shuō)明3個(gè)因素中對(duì)酶活力影響順序?yàn)檠b液量>接種量>誘導(dǎo)溫度；因?yàn)镕A>F0.9(2,8)=3.110>FB>FC，所以裝液量對(duì)重組菌的產(chǎn)酶量有顯著影響，而接種量和誘導(dǎo)溫度對(duì)產(chǎn)酶量的影響不顯著(表3)。

表2正交試驗(yàn)結(jié)果分析

Table 2Results and analysis of orthogonal test

實(shí)驗(yàn)號(hào)TestnumberABCE酶活力Enzymeactivity(U/mL)11111189.32521222215.93931333257.37042123184.38652231194.70862312204.11573132107.60583213118.55193321121.765K1220.878160.421170.677168.599K2194.416176.399174.030175.881K3115.956194.430186.543186.769R104.92234.00915.86618.170

表3正交試驗(yàn)方差分析

Table 3Variance analysis of orthogonal test

因素Factor偏差平方和Quadraticsum自由度VarianceF比FratioF臨界值Fcriticalvalue顯著性O(shè)bviousnessA17864.92823.4823.110*B1737.01320.3393.110C419.54620.0823.110E501.72320.0983.110總和Sum20523.218

注：*表示影響顯著

Note:*means significant influence

3討論

麥芽糖α-淀粉酶有來(lái)源于細(xì)菌和真菌，細(xì)菌來(lái)源的麥芽糖α-淀粉酶基因主要有枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)、嗜熱放線菌(Thermus vulgaris)等[16-17]。而真菌麥芽糖α-淀粉酶幾乎來(lái)源于絲狀真菌中的曲霉屬微生物，例如黑曲霉(Aspergillusniger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。而本研究中麥芽糖α-淀粉酶來(lái)源于綠色糖單孢菌，屬于細(xì)菌，它作用于20%淀粉后生成的主要產(chǎn)物為麥芽糖、麥芽三糖和少量葡萄糖，其中麥芽糖的含量可以達(dá)到67.15%。

大腸桿菌因自身產(chǎn)生內(nèi)毒素，從而限制了其在食品方面的應(yīng)用。目前商業(yè)化的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)主要用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，而IPTG不僅價(jià)格昂貴而且有毒，基于安全考慮，這也限制其在醫(yī)療和食品方面的重組蛋白表達(dá)的應(yīng)用。另外因?yàn)榇竽c桿菌自身問(wèn)題，在表達(dá)異源蛋白時(shí)很容易形成包涵體，從而使得可溶性蛋白表達(dá)量減少。

相較于大腸桿菌表達(dá)宿主，枯草芽孢桿菌因自身不產(chǎn)生內(nèi)毒素而沒(méi)有致病性，也沒(méi)有明顯的密碼子偏好性，而且還具有很好的分泌能力[18]，能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)直接分泌到胞外，避免了包涵體的形成，因此被認(rèn)為是表達(dá)外源蛋白的理想宿主。根據(jù)文獻(xiàn)[6]報(bào)道，sva在大腸桿菌宿主中表達(dá)的最高酶活力為168.699 U/mL，本研究在枯草芽孢桿菌中實(shí)現(xiàn)sva的高效分泌表達(dá)，胞外粗酶活力為257 U/mL。外源蛋白在枯草芽孢桿菌內(nèi)表達(dá)量仍然不高，主要是因?yàn)?(1)枯草芽孢桿菌自身在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期分泌表達(dá)大量的蛋白酶，能夠?qū)⒛康牡鞍捉到猓?2)質(zhì)粒的分化和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；(3)信號(hào)肽的適配性選擇。因此，目前研究熱點(diǎn)一方面是尋找一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，包括誘導(dǎo)型的蔗糖啟動(dòng)子，木糖啟動(dòng)子，淀粉啟動(dòng)子以及組成型啟動(dòng)子P43;另外一方面是得到與目的基因高度適配的信號(hào)肽[19]。

4結(jié)論

本研究利用PCR技術(shù)成功克隆到目的基因sva，連接到大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pHCMCO4-Pglv，成功構(gòu)建pHCMCO4-Pglv-sva，以B.subtilis 1A857為表達(dá)宿主實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，并且通過(guò)菌體生長(zhǎng)條件和發(fā)酵條件優(yōu)化后，確定最佳的發(fā)酵條件為誘導(dǎo)溫度37℃、接種量5%、裝液量25 mL，在此條件下獲得的胞外粗酶最高酶活力達(dá)到257 U/mL。

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(責(zé)任編輯：陸雁)

High Level Secretion Expression of Maltogenic α-amylase from Saccharomonospora viridis in Bacillus subtilis

柳梅梅1,2，謝敏1,2，楊燕芳1,2，劉滔滔1,2，杜麗琴1,2，梁智群1,2，韋宇拓1,2**

LIU Meimei1,2，XIE Min1,2，YANG Yanfang1,2，LIU Taotao1,2，DU Liqin1,2，LIANG Zhiqun1,2，WEI Yutuo1,2

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；2.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530005)

(1.College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi，530005，China；2.State Key Laboratory for Conservation and Utilizaiton of Subtropical Agro-bioresources，Nanning，Guangxi，530005，China)

摘要：【目的】構(gòu)建高產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶的工程菌株并實(shí)現(xiàn)高效分泌表達(dá)?！痉椒ā縋CR擴(kuò)增麥芽糖α-淀粉酶基因sva，再與大腸桿菌-枯草芽孢桿菌麥芽糖誘導(dǎo)型穿梭載體pHCMCO4-Pglv連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHCMCO4-Pglv-sva并轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌進(jìn)行表達(dá)，對(duì)重組酶進(jìn)行SDS-PAGE分析，然后對(duì)重組菌株的生長(zhǎng)及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。【結(jié)果】成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pHCMCO4-Pglv-sva并在枯草芽孢桿菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，在55 kDa處得到特異性蛋白條帶。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組菌的最適誘導(dǎo)溫度為35℃，最適接種量為4%(V/V)，最適裝液量為30 mL。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組菌的最佳發(fā)酵條件組合是誘導(dǎo)溫度37℃、接種量5%(V/V)、裝液量25 mL，在此條件下發(fā)酵液粗酶活力達(dá)到257.3698 U/mL。裝液量對(duì)重組菌的產(chǎn)酶量影響顯著?！窘Y(jié)論】成功構(gòu)建能高效分泌表達(dá)麥芽糖α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌工程菌株，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，重組酶產(chǎn)量顯著提高10倍左右。

關(guān)鍵詞:麥芽糖α-淀粉酶枯草芽孢桿菌高效表達(dá)優(yōu)化

Abstract:【Objective】 Engineering strains for high yield of maltose alpha amylase were constructed in order to implement efficient secrection expression.【Methods】The gene that had a length of 1 440 bp was amplified by PCR.The recombinant plasmid pHCMCO4-Pglv-sva was constructed and transformed into Bacillus subtilis.The recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE,and the growing conditions of recombinant strains were further optimized.【Results】The recombinant strain pHCMCO4-Pglv-sva was successfully constructed and expressed in Bacillus subtilis.The molecular weight of the recombinant protein was approximately 55 kDa by SDS-PAGE analyis.Single factor optimization of fermentation conditions revealed that the recombinant strain had the optimal induction temperature at 35℃,the optimal inoculated quantity of 4%(V/V) and the optimal loading fluid amount of 30 mL.Orthogonal experiment results showed that the optimum fermentation conditions were induction temperature at 37℃,quantity of 5%(V/V) and fluid volume 25 mL,under which the enzyme activity of recombinant maltose alpha amylase reached to 257.3698 U/mL.Among them,liquid loading quantity had significant effects on enzyme activity of maltose alpha amylase.【Conclusion】The recombinant plasmid pHCMCO4-Pglv-sva was successfully built and maltose alpha amylase was highly increased to ten times after optimizing fermentation condition.

Key words:maltose α-amylase，Bacillus subtilis，high efficient expression，optimization

中圖分類號(hào)：Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-9164(2016)01-0012-07

作者簡(jiǎn)介：柳梅梅(1989-)，女，碩士研究生，主要從事基因工程菌的構(gòu)建和酶工程研究。

收稿日期：2015-11-16

修回日期：2016-02-28

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160311)和廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012GXNSFAA053051)資助。

**通訊作者：韋宇拓(1971-)，男，教授，主要從事發(fā)酵與酶工程研究，E-mail：weiyutuo@gxu.edu.cn。

廣西科學(xué)Guangxi Sciences 2016,23(1):12～18

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-03-15

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160315.1511.016.html