梅 帆, 翟 婷, 鄭 念, 李 艷, 陳 勇, 婁兆文*

(1. 湖北大學 a. 有機化工新材料湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心； b. 化學化工學院； c. 生命科學學院，湖北 武漢 430062)

·研究論文·

新型厚樸酚2-甲亞胺衍生物的合成及其生物活性

梅 帆1a,1b, 翟 婷1a,1b, 鄭 念1a,1b, 李 艷1a,1b, 陳 勇1a,1c, 婁兆文1a,1b*

(1. 湖北大學 a. 有機化工新材料湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心； b. 化學化工學院； c. 生命科學學院，湖北 武漢 430062)

以厚樸酚為原料，通過Reimer-Tiemann法，在其苯環(huán)羥基鄰位引入甲酰基后，分別與甘氨酸、谷氨酸、精氨酸及對氨基苯磺酰胺反應合成了4個單取代、1個二取代新型厚樸酚2-甲亞胺衍生物(3a～3d和4)，其結構經(jīng)UV-Vis,1H NMR， IR， MS和元素分析表征。生物活性研究結果表明： 2-(N-甘氨酸)-厚樸酚甲亞胺(3a)對成肌細胞的毒性較大；2-[N-(4-氨磺酰苯基)]-厚樸酚甲亞胺(3d)濃度為64 μmol·L-1時，對CYP2D6和CYP1A2的抑制率分別為42.9%和36.8%。

厚樸酚； 氨基酸； Reimer-Tiemann法; 甲亞胺衍生物； 合成； 生物活性； 成肌細胞； CYPs

厚樸酚(5′,5-二烯丙基-2,2′-聯(lián)苯二酚)是我國傳統(tǒng)中藥材厚樸的主要活性成分之一，具有抗氧化、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)系統(tǒng)和抗?jié)兊人幚碜饔茫梢砸种菩律芗澳[瘤的生長，應用前景十分廣闊[1]。甘氨酸、谷氨酸和精氨酸分別是中性、酸性和堿性氨基酸[2]，是生物體重要的組成與功能物質。對氨基苯磺酰胺是磺胺藥物的基本結構[3]，在醫(yī)學上可直接作為藥物使用，具有預防和治療細菌感染性疾病及抑制細胞增殖等作用[4]。亞胺亦稱為希夫堿，可作為螯合劑、穩(wěn)定劑及生物活性試劑等，廣泛應用于生產(chǎn)及研究[5]。和厚樸酚作為厚樸酚的異構體，由于結構有利，有關其研究報道較多[6]。

Scheme 1

本文根據(jù)上述幾類化合物抗氧化等生理作用與作用位點的差異性，設計將具有一定生物活性的氨基酸、磺胺引入到厚樸酚結構中，以期通過協(xié)同作用機制，或同時在不同靶點發(fā)揮相應作用，獲得具有更高生物活性的修飾物。以厚樸酚為原料，通過Reimer-Tiemann法[7]，在其苯環(huán)羥基鄰位引入甲?；?，分別與甘氨酸、谷氨酸、精氨酸及對氨基苯磺酰胺反應合成了4個單取代、1個二取代新型厚樸酚2-甲亞胺衍生物(3a～3d和4， Scheme 1)，其結構經(jīng)UV-Vis,1H NMR， IR， MS和元素分析表征。并研究了3a和3d對成肌細胞的毒性和對體外人肝微粒體中CYPs的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Perkin-Elmer Lambda 35型紫外分光光度計(乙醇為溶劑)；INOVA 600 MHz型核磁共振儀(CD3OD為溶劑,TMS為內標)；Perkin-Elmer Spectrum one型紅外光譜儀(KBr壓片)；LCMS-8040型三重四極桿液相色譜質譜聯(lián)用儀；Elementar-Vario Micro Cube型元素分析儀。

成肌細胞，自行培養(yǎng)；混合人肝微粒體(Human Liver microsome, HLM)， BD Gentest；厚樸酚，含量≥98%，武漢泰凱塞科技有限公司；甘氨酸(分析純)和L-谷氨酸(生物試劑)，國藥集團化學試劑有限公司；精氨酸，生物試劑，天津博迪化工；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 1和2的合成

在反應瓶中依次加入厚樸酚2.66 g(0.01 mol)， 35%NaOH溶液20 mL和四丁基溴化銨0.1 g，攪拌下升溫至50 ℃，緩慢滴加氯仿5 mL，滴畢，于60～65 ℃反應3 h。用1 ∶1的HCl溶液調至pH 2，用氯仿萃取，合并萃取液，濃縮后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：二氯甲烷)純化得白色固體1 0.70 g和2 0.05 g。

1: 產(chǎn)率24%;1H NMR(CDCl3)δ： 9.916(s, 1H, 12-H), 7.430(d,J=5.4 Hz, 2H, 10,11-H), 7.329(s, 1H, 3-H), 7.117(d,J=8.4 Hz, 1H, 2-H), 6.970(d,J=8.4 Hz, 1H, 1-H), 5.988～5.891(m, 2H, 5,8-H), 5.123～5.026(m, 4H, 6,7-H), 3.414(d,J=6.6 Hz, 2H, 9-H), 3.349(d,J=6.6 Hz, 2H, 4-H); IRν: 3 401(OH), 1 651(CH=O) cm-1; MSm/z: 293.13[M-]。

2: 產(chǎn)率1.6%;1H NMR(CDCl3)δ： 9.922(s, 2H, 11,12-H), 7.449(s, 2H, 1,10-H), 7.379(s, 2H, 2,9-H), 6.088～5.991(m, 2H, 4,7-H), 5.163～5.126(m, 4H, 5,6-H), 3.412(d,J=4.2 Hz, 2H, 3-H), 3.253(d,J=4.2 Hz, 2H, 8-H); IRν: 1 650(CH=O) cm-1; MSm/z: 322.13[M-]。

(2) 3a～3d和4的合成(以3a為例)

在反應瓶中依次加入1 204 mg(1 mmol)，甘氨酸83 mg(1.1 mmol)和乙醇5 mL，攪拌使其溶解；于55 ℃反應1 h。減壓蒸除部分溶劑，冷卻，結晶，粗產(chǎn)品用無水乙醇重結晶得3a。

用類似方法合成3b～3d和4(2與甘氨酸投料比為1 ∶2.1)。

2-(N-甘氨酸)-厚樸酚甲亞胺(3a): 黃色固體，產(chǎn)率58%; UV-Visλmax： 220, 296, 426 nm；1H NMRδ： 8.458(s, 1H, 12-H), 7.445(s, 1H, 11-H), 7.223(s, 1H, 10-H), 7.150(s, 1H, 3-H), 7.074(d,J=12.6 Hz, 1H, 2-H), 6.872(d,J=12.6 Hz, 1H, 1-H), 6.096～5.978(m, 2H, 5,8-H), 5.160～5.047(m, 4H, 6, 7-H), 4.333(s, 2H, 13-H), 3.386(d,J=9.6 Hz, 4H, 4,9-H)； IRν: 3 417(OH), 1 638(CH=N), 1 402(OH) cm-1; MSm/z: 351.40[M-]。

2-(N-谷氨酸)-厚樸酚甲亞胺(3b)： 黃色固體，產(chǎn)率48%; UV-Visλmax: 220, 297, 427 nm;1H NMRδ： 8.469(s, 1H, 12-H), 7.366(s, 1H, 11-H), 7.184(s, 1H, 10-H), 7.081(s, 1H, 3-H), 7.014(d,J=7.8 Hz, 1H, 2-H), 6.818(d,J=7.8 Hz, 1H, 1-H), 6.019～5.936(m, 2H, 5,8-H), 5.101～4.994(m, 4H, 6,7-H), 4.235～4.214(m, 1H, 13-H), 3.334(d,J=1.8 Hz, 4H, 4,9-H), 2.419～2.014(m, 4H, 14,15-H)； IRν: 3 430(OH), 1 708(COO), 1 650(CH=N), 1 392(OH) cm-1; MSm/z: 422.17[M-]。

2-(N-精氨酸)-厚樸酚甲亞胺(3c)： 黃褐色固體，產(chǎn)率42%; UV-Visλmax: 220, 297, 427, 517, 547 nm；1H NMRδ： 8.495(s, 1H, 12-H), 7.432(s, 1H, 11-H), 7.217(s, 1H, 10-H), 7.136(s, 1H, 3-H), 7.097(d,J=12.0 Hz, 1H, 2-H), 6.893(d,J=12 Hz, 1H, 1-H), 6.072～5.989(m, 2H, 5,8-H), 5.158～5.046(m, 4H, 6,7-H), 4.265(t,J=22.8 Hz, 1H, 13-H), 3.481～3.453(m, 4H, 4,9-H), 2.253(t,J=22.8 Hz, 2H, 16-H), 1.762～1.629(m, 4H, 14,15-H); IRν: 3 368(OH), 1 643(CH=N) cm-1; Anal calcd for C25H30N4O4: C 66.67, H 6.67, N 12.44; found C 66.60, H 6.49, N 12.20。

2-[N-(4-氨磺酰苯基)]-厚樸酚甲亞胺(3d)： 深紅色固體，產(chǎn)率58%; UV-Visλmax： 222, 254, 291, 449 nm；1H NMRδ： 8.756(s, 1H, 12-H), 8.066(d,J=12.6 Hz, 2H, 14,16-H), 7.457(d,J=12.6 Hz, 2H, 13,15-H), 7.377(s, 1H, 11-H), 7.218(s, 1H, 10-H), 7.197(s, 1H, 3-H), 7.155(d,J=7.8 Hz, 1H, 2-H), 7.087(d,J=12 Hz, 1H, 1-H), 6.096～5.981(m, 2H, 5,8-H), 5.201～5.101(m, 4H, 6,7-H), 3.499(d,J=10.2 Hz, 2H, 4-H), 3.455(d,J=9 Hz, 2H, 9-H); IRν: 3 365(OH), 1 620(CH=N), 1 333(S=O), 1 157(S=O) cm-1; MSm/z: 447.16[M-]。

2,2-二(N-甘氨酸)-厚樸酚甲亞胺(4)： 黃色固體，產(chǎn)率55%; UV-Visλmax: 215, 296, 423 nm；1H NMRδ： 8.432(s, 2H, 11,13-H), 7.267(s, 2H, 1,10-H), 7.209(s, 2H, 2,9-H), 6.076～5.976(m, 2H, 4,7-H), 5.152～5.067(m, 4H, 5,6-H), 4.284(s, 4H, 12,14-H), 3.392(s, 4H, 3,8-H)； IRν: 3 422(OH), 1 634(CH=N) cm-1; MSm/z: 434.15[M2-]。

1.3 生物活性測試

(1) 配制不同濃度的3a DMSO溶液，按文獻[8]方法測試其對成肌細胞的毒性。

(2) 分別配制不同濃度的厚樸酚和3d DMSO溶液，運用HPLC與LS/MS檢測其同各個酶特異探針底物溫孵反應[9]后代謝產(chǎn)物的改變，評價其對人源性CYP1A2， CYP2E1， CYP3A4， CYP2C9和CYP2D6的酶活性影響變化[10]。

2 結果與討論

2.1 厚樸酚的Reimer-Tiemann反應

一般認為，Reimer-Tiemann法是酚類在相轉移等催化劑及氫氧化鈉存在下，氯仿生成 ∶CCl2，進而進攻酚負離子，再發(fā)生質子位移，中間體水解后得鄰位取代甲?；姆磻a(chǎn)率一般在50%～70%[11]。厚樸酚通過R-T法合成1的產(chǎn)率只有24%，轉化率較低。經(jīng)過仔細分析，我們認為這是因為在厚樸酚的結構中有相鄰的兩個羥基(OH)存在，當二氯卡賓進攻酚負離子時，易形成原三酯類化合物A和B(Chart 1)。該類物質不易水解，aμmol·L-1,b非那西丁為底物,c氯唑沙宗為底物,d睪酮為底物,e甲苯磺丁脲為底物,f右美沙芬為底物。

表1 3a對成肌細胞的毒性實驗結果

表2 厚樸酚和3d對CYP450酶系活性影響

Chart 1

且阻止了Reimer-Tiemann反應在酚羥基鄰位作用的中間體形成，降低了甲?；霓D化率，甚至得不到目標產(chǎn)物。而在和厚樸酚的分子結構中，不同苯環(huán)上的羥基相隔較遠，不能形成類似A和B型化合物，能較順利進行Reimer-Tiemann反應[6]。這也可能是和厚樸酚報道多卻難見厚樸酚相關產(chǎn)物的一個原因。

另外，在實驗過程中，NaOH溶液的濃度及反應結束時酸化條件對1的產(chǎn)率有較大影響。在堿濃度較低或酸化時pH過低，也會使副產(chǎn)物原甲酸三酚醛大量增加[12]，并降低1的轉化率。

2.2 生物活性

3a對成肌細胞的毒性實驗結果[8]見表1。由表1可見，當3a濃度為10 μmol·L-1時，細胞存活率僅1/3，表明3a對成肌細胞的毒性較大。

在相同條件下，以厚樸酚為對照組，依次以特定的探針底物為觀測對象，研究3d在不同濃度下對人肝臟CYP450酶系活性的影響[13]，實驗結果見表2。由表2可以看出，隨著厚樸酚和3d濃度增大,CYP1A2， CYP2E1， CYP3A4， CYP2C9和CYP2D6的酶活性整體呈降低趨勢，表明隨著濃度提高，厚樸酚和3d酶活性抑制率逐漸加大。其中，3d對CYP2E1酶的活性抑制率明顯強于厚樸酚；兩者對于CYP3A4和CYP2C9酶的活性抑制率整體上較接近；在低濃度條件下(1 μmol·L-1, 2 μmol·L-1, 4 μmol·L-1)， 3d對CYP1A2酶活性抑制率要強于厚樸酚，但在高濃度(8 μmol·L-1, 16 μmol·L-1, 32 μmol·L-1, 64 μmol·L-1)時則相反；但CYP2D6酶的情況卻正好與CYP1A2酶相反。該研究結果表明，在厚樸酚結構中引入相應基團后，對其生物活性有明顯影響。

3 結論

以厚樸酚為起始原料合成了4個單取代、1個二取代新型厚樸酚2-甲亞胺衍生物(3a～3d和4)。生物活性研究結果表明： 2-(N-甘氨酸)-厚樸酚甲亞胺(3a)對成肌細胞的毒性較大；2-[N-(4-氨磺酰苯基)]-厚樸酚甲亞胺(3d)濃度為64 μmol·L-1時，對CYP2D6和CYP1A2的抑制率分別為42.9%和36.8%。

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Synthesis and Biologial Activities of Novel Magnolol 2-Azomethine Derivatives

MEI Fan1a,1b, ZHAI Ting1a,1b, ZHENG Nian1a,1b,LI Yan1a,1b, CHEN Yong1a,1c, LOU Zhao-wen1a,1b*

(a. Organic Chemical Materials Collaborative Innovation Center in Hubei;b. Chemistry and Chemical Engineering; c. College of Life Sciences, 1. Hubei University, Wuhan 430062, China)

The formoxyl was introduced into the ortho-position of magnolol hydroxy by the Reimer-Tiemann method using magnolol as the raw material. Four novel mono-substituted and one bis substituted magnolol 2-azomethine derivatives were synthesized by reaction of the formylated magnolol with glycine, glutamic acid, arginine and sulfanilamide, respectively. The structures were characterized by UV-Vis,1H NMR, IR, MS and elemental analysis. The myoblast cell toxicity and the effects on CYPs in liver microsomesinvitrohuman were investigated. The results showed that 2-(N-glycine)-magnolol azomethine(3a) exhibited certain tomyoblasts toxicity. At 64 μmol·L-1, the inhibition rate of 2-[N-(4-sulfamoyl-phenyl)]-magnolol azomethine(3d) on CYP2D6 and CYP1A2 was 42.9% and 36.8%, respectively.

magnolol; amino acid; Reimer-Tiemann method; azomethine derivative; synthesis; biologial activity; myoblast; CYPs

2015-04-09； 修訂日期： 2016-01-28

梅帆(1988-)，男，漢族，湖北麻城人，碩士研究生，主要從事有機小分子的合成研究。 E-mail: 744955309@qq.com

婁兆文，教授， E-mail: 438208880@qq.com

O625.41

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.04.15145