劉　鑒，裘學(xué)麗，陳　艷

(貴州醫(yī)科大學(xué)人體寄生蟲學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng)　550004)

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貴州安順王錦蛇體內(nèi)猬迭宮絳蟲成蟲及裂頭蚴超微結(jié)構(gòu)*＊?

劉鑒，裘學(xué)麗，陳艷＊＊

(貴州醫(yī)科大學(xué)人體寄生蟲學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng)550004)

［摘要］目的:觀察貴州安順王錦蛇體內(nèi)猬迭宮絳蟲成蟲和裂頭蚴的超微結(jié)構(gòu)。方法:采集安順地區(qū)王錦蛇體內(nèi)的裂頭蚴，進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子鑒定;將裂頭蚴喂飼感染犬(10條/犬) 1月后剖殺，獲得成蟲，將成蟲及裂頭蚴標(biāo)本用戊二醛－鋨酸雙重固定、乙醇梯度脫水、真空冷凍干燥及噴金后，用S-3400掃描電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果: (1)裂頭蚴經(jīng)cox1基因片段測(cè)序結(jié)果與GenBank中的猬迭宮絳蟲(登錄號(hào)GQ999947)的基因序列一致性為99.12%; (2)成蟲體表微毛覆蓋，背、腹面上各有一條縱行的吸槽，其內(nèi)面的微毛呈絲狀型，其余部位呈圓錐狀棘狀型;成蟲頭節(jié)呈指狀、頸部短而粗，成節(jié)和孕節(jié)腹面有5條縱行的半球形顆粒狀丘團(tuán)，在成節(jié)腹面上部中央，從上而下，可見雄性生殖孔、雌性生殖孔及子宮孔，可見陰莖自雄性生殖孔伸出，陰莖呈短圓柱狀，生殖孔周圍由許多生殖乳突圍繞; (3)裂頭蚴呈長(zhǎng)帶狀，前后兩端略膨大，不分節(jié)，但表面有深的不規(guī)則的橫向皺褶;蟲體前端中央有一窄橫向凹陷，周圍體壁呈唇狀突起，后端的結(jié)構(gòu)類似前端，但中央的凹陷及唇狀突起較前端扁平;蟲體體表密布微毛，微毛的長(zhǎng)短不一，前段及后段的微毛為圓錐狀的棘狀型，中段的微毛有圓錐狀、棘狀型和鑲嵌在圓錐狀微毛中矛尖狀的棘狀型，后者數(shù)量較少。結(jié)論:通過對(duì)貴州安順王錦蛇體內(nèi)猬迭宮絳蟲成蟲和裂頭蚴的超微結(jié)構(gòu)觀察，有助于王錦蛇體內(nèi)猬迭宮絳蟲的后續(xù)研究。

［關(guān)鍵詞］王錦蛇;迭宮絳蟲屬;裂頭蚴;成蟲;動(dòng)物結(jié)構(gòu);顯微鏡檢查，電子，掃描

＊＊通信作者E-mail: chenyan757@ sina.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2016－02－23網(wǎng)絡(luò)出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.2005.028.html

猬迭宮絳蟲的終宿主、中間宿主和轉(zhuǎn)續(xù)宿主廣泛，在長(zhǎng)期的進(jìn)化演變進(jìn)程中，蟲體在與宿主之間的相互適應(yīng)中會(huì)發(fā)生形態(tài)改變［1－3］，但近年來(lái)對(duì)猬迭宮絳蟲蟲株間形態(tài)的研究較為薄弱，許多方面并不十分清楚［4］。許世鍔等［5］曾對(duì)猬迭宮絳蟲的成蟲及裂頭蚴進(jìn)行過掃描電鏡觀察，成蟲取自感染的犬和貓，裂頭蚴取自于蛙。對(duì)成蟲的觀察較為詳細(xì)，但對(duì)裂頭蚴的觀察較為粗略。Osaki［6］對(duì)取自日本四線錦蛇(Elaphe quadrivirgata)的猬迭宮絳蟲裂頭蚴的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了電鏡觀察，亦有學(xué)者對(duì)黑斑蛙(Rana nigromaculata)的裂頭蚴進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，但都沒有作比較性研究［7－8］。本實(shí)驗(yàn)用掃描電鏡對(duì)貴州安順野生王錦蛇體內(nèi)的裂頭蚴及用其感染犬后獲得的成蟲的體表結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并與其他作者的觀察結(jié)果進(jìn)行比較。

1　材料及方法

1.1蟲種來(lái)源

野生王錦蛇，采自貴州省安順地區(qū)。按照參考文獻(xiàn)［9］自蛇體內(nèi)檢獲裂頭蚴，生理鹽水清洗后，進(jìn)行分子鑒定。同時(shí)將裂頭蚴喂飼感染犬(10條/ 犬)，1月后剖殺，獲得成蟲。

1.2主要試劑與儀器

所用試劑均為分析純，真空噴鍍儀(JEE-5B)為日電公司產(chǎn)品，掃描電鏡(S-3400N)、臨界點(diǎn)干燥器(HCP-2)和離子濺射儀(E-1010)為日立公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1裂頭蚴分子鑒定檢獲的裂頭蚴，提取DNA，以猬迭宮絳蟲種特異性引物(cox1F為TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT，cox1R為TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG)進(jìn)行PCR。

1.3.2掃描電鏡觀察選取活動(dòng)較好的裂頭蚴及成蟲各5條，成蟲切取頭節(jié)、幼節(jié)、成節(jié)及孕節(jié)，在4℃條件下經(jīng)2.5%戊二醛固定過夜，然后用1%鋨酸固定2 h，經(jīng)各級(jí)酒精脫水，真空冷凍干燥，再將干燥的標(biāo)本固定在載物臺(tái)上，離子噴涂?jī)x鍍金，用日立S-3400N型掃描電鏡觀察并拍照。

2　結(jié)果

2.1分子鑒定

經(jīng)PCR擴(kuò)增后，可得到約400 bp的產(chǎn)物。cox1基因片段測(cè)序結(jié)果與GenBank中的猬迭宮絳蟲(登錄號(hào)GQ999947)的基因序列一致性為99.12%。

2.2裂頭蚴掃描電鏡觀察

裂頭蚴扁平帶狀，前后二端略膨大，不分節(jié)，但表面有深的不規(guī)則的橫向皺褶。頂端中央有一橫向凹陷，凹陷周圍體壁呈唇狀突起。體表的質(zhì)膜內(nèi)陷形成大小不等的凹窩與溝紋。整個(gè)蟲體體表密布微毛，微毛的長(zhǎng)短不一。蟲體前端的微毛為圓錐狀的棘狀型，而體中段的微毛有兩種類型，一種為圓椎狀的棘狀型，另一種呈矛尖狀的棘狀型微毛，數(shù)量較少，鑲嵌在圓錐狀微毛中。蟲體后端的中央也有一橫向凹陷，凹陷周圍體壁也呈唇狀突起，但較前端的扁平(圖1)。

A為裂頭蚴整體觀(×12) ; B為裂頭蚴前端側(cè)面觀(×150) ; C為頭端微毛，微毛呈圓錐狀的棘狀型(×10 000) ; D為體中部微毛，微毛有兩型，即圓錐狀(黃箭頭)和矛尖狀(綠箭頭，×20 000)圖1　王錦蛇體內(nèi)裂頭蚴掃描電鏡圖像Fig.1　Scanning electron microscopy pictures of Plerocercoids in the wild Elaphe carinata

2.3成蟲掃描電鏡觀察

成蟲頭節(jié)呈指狀，背、腹面上各有一條縱行的吸槽。因頸部短而粗，使頭節(jié)到頸部的轉(zhuǎn)化不明顯。整個(gè)成蟲體表被微毛所覆蓋，槽內(nèi)面的微毛呈絲狀型，頭節(jié)其余部位、頸部及鏈體表面均密布圓錐狀棘狀型微毛。成節(jié)和孕節(jié)的結(jié)構(gòu)基本相同，節(jié)片背面除微毛外無(wú)其他結(jié)構(gòu)，腹面有5條縱行的丘團(tuán)，每個(gè)丘團(tuán)又由許多半球形顆粒組成。在節(jié)片腹面上部中央，從上而下，可見雄性生殖孔、雌性生殖孔及子宮孔。有些節(jié)片可見到陰莖自雄性生殖孔伸出，陰莖呈短圓柱狀。生殖孔周圍由許多生殖乳突圍繞(圖2)。

A為頭端整體觀，見二個(gè)槽狀吸槽(箭頭示) (×150) ; B為頭端部位的微毛，呈圓錐狀的棘狀型(×10 000) ; C為頭節(jié)槽內(nèi)面微毛，呈絲狀型(×10 000) ; D為幼節(jié)部位微毛(×10 000) ; E為成節(jié)腹面觀，雄性生殖孔(白箭頭)，綠箭頭示子宮孔(×60) ; F為成節(jié)子宮孔，自子宮孔排出的蟲卵(綠箭頭)，圍繞子宮孔的生殖乳突(藍(lán)箭頭，×500) ; G為短圓柱形的陰莖自雄性生殖孔中伸出(綠箭頭)，藍(lán)箭頭示生殖乳突(×1 000) ; H為成節(jié)邊緣處的丘團(tuán)(×300) ; I為成節(jié)邊緣處丘團(tuán)，呈半球形，其上覆蓋微毛(×10 000) ; J為生殖乳突，其上覆蓋微毛(×5 000) ; K為幼節(jié)腹面觀(×100) ; L為成蟲背面觀(×30)圖2　王錦蛇體內(nèi)猬迭宮絳蟲成蟲掃描電鏡圖像Fig.2　Scanning electron microscopy pictures of adult Spirometra erinalei in the wild Elaphe carinata

3　討論

通過掃描電鏡對(duì)王錦蛇來(lái)源猬迭宮絳蟲的成蟲進(jìn)行觀察，其結(jié)果與許世鍔等［5］的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，成蟲超微結(jié)構(gòu)的不同點(diǎn)主要表現(xiàn)在: (1)許世鍔等［5］觀察到的成蟲，其頭節(jié)背腹吸槽的內(nèi)面無(wú)微毛，而王錦蛇體內(nèi)裂頭蚴吸槽的內(nèi)面密布許多絲狀型微毛; (2)許世鍔等［5］報(bào)道的成蟲成節(jié)腹面有3條縱行的丘團(tuán)狀隆起，兩側(cè)的2條對(duì)稱地位于節(jié)片左右三分之一處，每條由4～6個(gè)不規(guī)則圓形丘團(tuán)縱行排列而成，每個(gè)丘團(tuán)又由許多半球形顆粒組成，表面附著微絨毛，在一些節(jié)片中，有時(shí)在兩側(cè)近邊緣處也可看到一些類似的丘團(tuán);王錦蛇來(lái)源成蟲成節(jié)腹面有5條縱行的丘團(tuán)狀隆起，兩側(cè)的4條對(duì)稱地位于節(jié)片左右近中央處及外側(cè)邊緣處。

通過掃描電鏡對(duì)王錦蛇體內(nèi)猬裂頭蚴進(jìn)行觀察，其結(jié)果與其他學(xué)者報(bào)道的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，裂頭蚴超微結(jié)構(gòu)的不同點(diǎn)主要表現(xiàn)在: (1)徐婧等［8］對(duì)黑斑蛙體內(nèi)裂頭蚴進(jìn)行觀察，見蟲體前端無(wú)吸槽，頂端中央有一橫向凹陷，凹陷周圍體壁呈明顯的唇狀突起，但王錦蛇體內(nèi)裂頭蚴，其頂端中央的橫向裂隙較黑斑蛙體內(nèi)裂頭蚴的淺和窄，且裂隙周圍體壁形成的唇狀突起也沒有黑斑蛙體內(nèi)裂頭蚴的典型; (2) Osaki［6］對(duì)日本四線錦蛇體內(nèi)的猬迭宮絳蟲裂頭蚴的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了透射電鏡觀察，見蟲體的體表密布微毛，微毛有兩種類型，一種為圓錐狀的棘狀型，另一種呈指狀型;徐婧等［8］觀察黑斑蛙體內(nèi)裂頭蚴，見整個(gè)蟲體體表密布圓錐狀的棘狀型微毛，微毛的長(zhǎng)短不一;王錦蛇體內(nèi)裂頭蚴的整個(gè)蟲體體表也密布微毛，但蟲體中段的微毛也有兩種類型，一種圓錐狀的棘狀型，另一種呈矛尖形的棘狀型，數(shù)量少，鑲嵌在圓錐狀的微毛中間。

經(jīng)比較，兩種宿主來(lái)源成蟲的掃描電鏡觀察結(jié)果十分相似，出現(xiàn)的差異不是蟲體本身結(jié)構(gòu)上的差異，而是作者描述上的差異。從許世鍔等［5］報(bào)道的文獻(xiàn)獲知，其觀察的成蟲取自感染的犬和貓，而裂頭蚴取自蛙，但犬和貓是自然感染還是實(shí)驗(yàn)感染、犬和貓感染的裂頭蚴來(lái)自蛙還是蛇、蛇和蛙的種類是否進(jìn)行過種類鑒定等，這些資料文章中都沒有作詳細(xì)記錄。從許世鍔等［5］的結(jié)果來(lái)看，推測(cè)觀察的成蟲有可能為蛇源裂頭蚴感染犬而獲得的成蟲。許世鍔等［5］描述的吸槽內(nèi)面無(wú)微絨毛，有兩個(gè)可能的原因，一是該株成蟲的確無(wú)微毛，二是觀察的年代較早，當(dāng)時(shí)電鏡的分辨率較低。另外，許世鍔等［5］描述的成節(jié)腹面有3條縱行的丘團(tuán)隆起，只在一些節(jié)片邊緣處可見類似的丘團(tuán)。王錦蛇來(lái)源成蟲成片腹面有5條縱行丘團(tuán)隆起，節(jié)片兩側(cè)近邊緣處的2條縱行丘團(tuán)隆起是十分明顯的，并非只在一些節(jié)片中見到。推測(cè)兩株成蟲出現(xiàn)差異的原因可能與觀察的成節(jié)節(jié)片的成熟度有關(guān)，也可能與作者的描述有一定的關(guān)系。

用電鏡技術(shù)觀察絳蟲皮層外微毛的形態(tài)與結(jié)構(gòu)特征，不僅可用于蟲株的鑒定，還可用于結(jié)構(gòu)與功能、藥物作用部位等方面的研究［10］。對(duì)迭宮絳蟲的超微結(jié)構(gòu)的研究，有助于了解蟲體的生理功能、不同宿主來(lái)源蟲株之間的生物學(xué)特性及差異，為進(jìn)一步研究迭宮絳蟲的分類、致病、診斷及防治等方面奠定基礎(chǔ)。本次觀察的王錦蛇體內(nèi)裂頭蚴與黑斑蛙、日本四線錦蛇體內(nèi)裂頭蚴的主要區(qū)別表現(xiàn)在微毛類型的不一。微毛類型的差異，可能與裂頭蚴為了適應(yīng)不同的寄生宿主而發(fā)生的形態(tài)改變有關(guān)，但不同宿主來(lái)源裂頭蚴之間是否存在基因水平上的差異［11］，仍需進(jìn)一步作分子鑒定。

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(2015－09－01收稿，2015－12－22修回)

中文編輯:吳昌學(xué);英文編輯:趙毅

Ultrastructure of Adult Spirometra erinacei and Pleroceroid within Elaphe carinata in Guizhou Anshun District

LIU Jian，QIU Xueli，CHEN Yan
(Department of Parasitology，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China)

［Abstract］Objective: To observe the ultrastructure of adult Spirometra erinacei and Pleroceroid within Elaphe carinata in Anshun District，Guizhou Province.Methods: Pleroceroids were collected from the wild Elaphe carinata in Anshun district，and were identified morphologically and PCR.The dogs were orally infected with Pleroceroids (10 Pleroceroids/each dog).After 4 weeks，infected dogs were sacrificed to observe and collect adult parasites.The Pleroceroids and adult parasites samples were fixed by glutaraldehyde osmic acid，dehydrated in graded series of ethanol，dried via vacuum freeze and coated with carbon gold.They were then observed by scanning electron microscopy(S-3400N).

［Key words］Elaphe carinata; Spirometra erinacei; Pleroceroid; adult; animal structure; microscopy examination，electron，scanning

*［基金項(xiàng)目］貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目［黔科合SY字(2014) 3024號(hào)］

［中圖分類號(hào)］R382

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1000-2707(2016) 02-0158-04

Results: (1) Results of gene sequencing of adult Pleroceroids had gene order consistency of 99.12% with Spirometra erinacei in GenBank (Registration No.GQ999947) ; (2) adult parasite body was covered by microtriches，a longitudinal bothrium runs along the back and ventral side respectively; its interior microtriches were in silklike form of，the rest in cone shape spine-like form; scolex was in finger like shape，neck part was short and thick; five longitudinal papillaes run along ventral surface of mature proglottids and gravid proglottid venter.In the middle of mature proglottids had male gentital pore，fe-male genital pore and uterus pore from top to bottom.Cylindroid cirrus could be seen protruding from the male genital pore in some mature proglottids，around which genital papilla were densely arranged.(3) The anterior and posterior ends of the Pleroceroids were slightly swell and without segmentation.Horizontal furrows ran irregularly along the body surface.The anterior end center was drawn inside which was a narrow dorsoventral hollow，around which，the plasma membrane displayed a lip bulge.Posterior structure was similar with the anterior one，just the drawn inside end center and lip bulge was flatter.The whole body surface of the Pleroceroids was densely covered by microtriches which differed in length.The microtriches of anterior and posterior segments were coniform spinithrix，while microtriches displayed two types (coniform spinithrix and lanceolate spinithrix) in the middle segment.Few lanceolate spinithrix were embedded in the coniform spinithrix.Conclusions: The studies of ultrastructure of adult Spirometra erinacei is benefitial for the future study of adult Spirometra erinacei and Pleroceroid within Elaphe carinata in Anshun District.