許建林，梁曉燕，南永剛，趙 華，施常備

（1.陜西省腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，陜西西安 710061；2.陜西省人民醫(yī)院放射科，陜西西安 710068；3.陜西省腫瘤醫(yī)院頭頸科，陜西西安 710061）

NIS mRNA在分化型甲狀腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

許建林1，梁曉燕2，南永剛1，趙 華3，施常備1

（1.陜西省腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，陜西西安 710061；2.陜西省人民醫(yī)院放射科，陜西西安 710068；3.陜西省腫瘤醫(yī)院頭頸科，陜西西安 710061）

目的 觀(guān)察鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體（sodium/iodide symporter，NIS）mRNA在分化型甲狀腺癌組織中的表達(dá)，并進(jìn)一步探討其在分化型甲狀腺癌診治中的作用和價(jià)值。方法 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法觀(guān)察NIS mRNA在21例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、45例分化型甲狀腺癌（包含35例甲狀腺乳頭狀癌和10例甲狀腺濾泡狀癌）組織中的表達(dá)，分析NIS轉(zhuǎn)錄表達(dá)與甲狀腺癌各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果 與良性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫相比，分化型甲狀腺癌組織中NIS mRNA表達(dá)顯著下降（P＜0.05）。NIS mRNA表達(dá)雖然與分化型甲狀腺癌患者的年齡、性別、腫瘤大小以及組織病理學(xué)類(lèi)型無(wú)關(guān)，但與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及與腫瘤臨床AJCC分期密切相關(guān)（P＜0.05）。有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者NIS mRNA表達(dá)量比無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著下降（P＜0.05）。此外，Ⅲ～Ⅳ期腫瘤患者癌組織NIS mRNA表達(dá)量比Ⅰ～Ⅱ期顯著下降（P＜0.05）。結(jié)論 NIS表達(dá)差異可以為分化型甲狀腺癌個(gè)性化放射性碘治療提供依據(jù)。

分化型甲狀腺癌；鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體（NIS）；放射性碘治療；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

甲狀腺癌（thyroid carcinoma，TC）是目前最常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一，也是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤之一［1－2］。近年來(lái)我國(guó)乃至世界TC的發(fā)病呈明顯上升和年輕化的趨勢(shì)［1－4］。分化型甲狀腺癌（differentiated thyroid carcinoma，DTC）包括乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、濾泡狀癌（follicular thyroid carcinoma，F(xiàn)TC）和嗜酸性細(xì)胞癌（Hürthle cell cancer），是TC中發(fā)病率最高的腫瘤，約占所有TC 的95％左右［4－5］。DTC總體預(yù)后較為良好，病程進(jìn)展相對(duì)緩慢，惡性程度相對(duì)較低。研究表明，手術(shù)、131碘和甲狀腺素制劑替代治療后，雖然大多數(shù)DTC患者預(yù)后良好，但仍有約30％DTC患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而且轉(zhuǎn)移患者的2/3出現(xiàn)病灶對(duì)131碘抵抗［6］，但其具體原因與機(jī)制尚不明確。

鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體（sodium/iodide symporter，NIS）是甲狀腺濾泡細(xì)胞基底膜上的一種跨膜糖蛋白［1，5，7－8］，人類(lèi)hNIS基因位于19號(hào)染色體短臂上，由643個(gè)氨基酸組成，NIS能選擇性、主動(dòng)性地轉(zhuǎn)運(yùn)血液中的碘進(jìn)入濾泡上皮細(xì)胞，碘化甲狀腺球蛋白上的酪氨酸殘基，通過(guò)溶酶體的作用分解成甲狀腺激素，并以囊泡的形式將甲狀腺激素釋放到血液中［7－9］。NIS對(duì)于活性碘的轉(zhuǎn)運(yùn)不僅是生理合成甲狀腺激素的重要限速步驟，同時(shí)也是臨床上利用放射性碘的方法來(lái)評(píng)價(jià)、診斷和治療甲狀腺疾病的基礎(chǔ)［9－10］。然而，目前關(guān)于NIS在DTC腫瘤組織中的表達(dá)情況尚存在爭(zhēng)議［1，4－5，11－12］，并且當(dāng)前的研究大多數(shù)都是針對(duì)NIS蛋白的研究，關(guān)于NIS轉(zhuǎn)錄水平的研究非常有限。因此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)NIS mRNA在人類(lèi)DTC組織中的表達(dá)情況，通過(guò)分析NIS表達(dá)與TC臨床病理參數(shù)之間的相互關(guān)系，探討NIS在DTC診斷以及放射性碘治療中的意義和價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源與采集 收集陜西省腫瘤醫(yī)院2012 年1月至2013年12月間臨床資料完整的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和DTC患者，本次共收集結(jié)節(jié)性甲狀腺腫21例（其中男性6例，女性15例），年齡（45.57±13.11）歲。DTC共45例（其中男性8例，女性37例）；年齡（51.91±12.59）歲；其中乳頭狀癌35例，濾泡性癌10例；頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例；根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）擬定的最新DTC分期標(biāo)準(zhǔn)，AJCC腫瘤分期Ⅰ期20例，Ⅱ期9例，Ⅲ期10例，Ⅳ期6例。所有病例術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療以及服用甲狀腺素類(lèi)藥物等治療。采集手術(shù)標(biāo)本，取材前征得患者同意并簽訂知情同意書(shū)，所有標(biāo)本均用RNA酶抑制劑處理過(guò)的錫箔紙包裹，并于取材后立即記錄，標(biāo)記并置入液氮內(nèi)冷凍保存。

1.2 主要試劑 SYBR Green熒光染料試劑盒［TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司］，Trizol試劑、RT試劑盒（美國(guó)的Promega公司），PCR引物（上海生工生物工程技術(shù)公司合成）等。

1.3 組織總RNA提取 首先利用Trizol法提取組織總RNA，具體過(guò)程為：在100mg液氮冰凍組織中加入Trizol 1mL，勻漿后加入0.2mL氯仿混勻，離心后吸取上清，加入0.5mL異丙醇，離心沉淀后棄上清，700mL/L乙醇洗沉淀，DNaseⅠ酶解可能殘余的基因組DNA。利用10g/L瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測(cè)提取的總RNA質(zhì)量和濃度。余RNA經(jīng)凍干機(jī)凍干20～30min，完全變?yōu)楦煞蹱詈螅糜冢?0℃冷凍保存。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄制備模板cDNA 反應(yīng)體系20μL：在裝盛RNA干粉的EP管中加入DEPC水30μL充分溶解，從中取11μL溶解液置于另一新EP管中，加入5×反應(yīng)緩沖液4μL，隨機(jī)引物1μL，RNA酶抑制劑1μL，M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，10mmol/L dN TP混合物2μL。擴(kuò)增條件：20℃10min，42℃60min，70℃5min。冰浴冷卻，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)文獻(xiàn)［13］設(shè)計(jì)RCR引物。NIS上游引物：5′－GTCGTGGTGATGCTAAGTG－3′，下游引物：5′－CTCGGGTCAGGGTTAAAG－3′，RCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度134bp。內(nèi)參β－actin上游引物：5′－TTATCTTAGTGCCTCTGTATGTC－3′，下游引物：5′－TTTTGATCTTTCTGGTGG－3′，RCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度146bp。引物均由上海生工有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量使用TaKaRa公司SYBR premix Ex TaqTM（perfect real time）試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，在A(yíng)BI PRISM7500Real－time PCR System中進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為25μL，其中cDNA模板1μL，SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，雙蒸水10μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)退火末檢測(cè)熒光信號(hào)，進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。收集數(shù)據(jù)，測(cè)定各樣品的Ct （cycle threshold，擴(kuò)增拷貝數(shù)）值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比較，得出待測(cè)樣品的拷貝數(shù)。為了消除樣本、逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)的差異，NIS mRNA的表達(dá)量采用各標(biāo)本定量的Ct值與相同標(biāo)本的內(nèi)參照基因定量的Ct值之比來(lái)表示。同時(shí)，在PCR反應(yīng)過(guò)程中，設(shè)定無(wú)cDNA樣品的空白管作為陰性對(duì)照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，組間比較采用One－way方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和DTC組織總RNA提取 結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和DTC組織提取的總RNA經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳，均可見(jiàn)28S、18S和5S三條帶，無(wú)DNA污染條帶及明顯降解條帶，表明各組織均提取到總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度，比值為A260/A280＞1.8，表明RNA純度較高。

2.2 NIS mRNA在不同類(lèi)型甲狀腺病變組織中的表達(dá)情況 結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中NIS mRNA的表達(dá)量為0.71±0.08，而DTC組織中NIS mRNA表達(dá)量為0.45±0.12。與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫相比，DTC組織NIS mRNA水平的表達(dá)量顯著下降（P＜0.01，表1）。

表1 NIS mRNA在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫與DTC組織中表達(dá)的比較Tab.1 Comparison of NIS mRNA expression in nodular goiter and differentiated thyroid carcinoma

2.3 NIS mRNA在DTC組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 NIS mRNA表達(dá)與DTC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系見(jiàn)表2。由表可見(jiàn)，NIS mRNA表達(dá)與患者年齡、性別，腫瘤大小無(wú)關(guān)（P＞0.05）；此外，NIS mRNA表達(dá)與腫瘤組織學(xué)類(lèi)型也無(wú)關(guān)，也就是說(shuō)乳頭狀癌與濾泡狀癌之間NIS mRNA表達(dá)未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

但是，NIS mRNA表達(dá)與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05）。有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組腫瘤組織NIS mRNA表達(dá)量（0.39±0.12）與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組腫瘤組織NIS mRNA表達(dá)量（0.48±0.10）相比顯著下降（P＜0.05）。

此外，NIS mRNA表達(dá)與腫瘤臨床AJCC分期密切相關(guān)（P＜0.05）。AJCCⅢ－Ⅳ期患者腫瘤組織NIS mRNA表達(dá)量（0.49±0.11）與AJCCⅠ～Ⅱ期患者腫瘤組織NIS mRNA表達(dá)量（0.40±0.12）相比顯著下降（P＜0.05）。

3 討論

TC是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，占所有人類(lèi)惡性腫瘤的1.6％［1－4］。2011年美國(guó)確診甲狀腺新發(fā)腫瘤病例48 020例，占內(nèi)分泌腫瘤的95.3％，占所有新發(fā)腫瘤的3％左右［3］。我國(guó)研究也顯示TC以每年6.2％的速率不斷增長(zhǎng)［14］。在TC發(fā)病患者中，約95％的患者均屬于DTC［4－5］。目前，在DTC的治療中，主要采取包括手術(shù)、放射碘治療、抑制TSH在內(nèi)的綜合治療方式，雖然有較好的治療效果，但仍然具有較高的復(fù)發(fā)率［6，15］。此外，也有研究報(bào)道顯示有部分DTC在治療或自然病程過(guò)程TSH受體表達(dá)降低和濃聚碘的能力喪失，使放射性碘治療和甲狀腺素抑制TSH治療難以奏效，即放射性碘難治性癌［16］，但目前其中具體的分子機(jī)制尚不清楚。

表2 NIS mRNA的表達(dá)與DTC的臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系Tab.2 Relationship between the expression of NIS mRNA and the clinicopathological parameters of differentiated thyroid carcinoma

NIS是一種分布在甲狀腺組織濾泡細(xì)胞基底膜上的糖化膜蛋白，其功能是作為“碘泵”，借助鈉/鉀交換而產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)外鈉濃度梯度來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)血液內(nèi)的碘進(jìn)入濾泡細(xì)胞，參與甲狀腺激素合成［7－9］。NIS所具有的聚碘功能是甲狀腺核素顯像的重要基礎(chǔ)，同時(shí)它也是放射性碘治療TC的理論基礎(chǔ)。然而當(dāng)前針對(duì)NIS在DTC中的定量的報(bào)道相對(duì)較少。鑒于此，本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)NIS在DTC中的表達(dá)進(jìn)行分析，旨在為患者的放射碘個(gè)性化治療提供依據(jù)，并從分子角度探索TC碘抵抗的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)顯示，在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中NIS mRNA的表達(dá)量為0.71±0.08，而DTC組織中NIS mRNA表達(dá)量為0.45±0.12。與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫相比，DTC組織NIS mRNA水平的表達(dá)量顯著下降。這一研究結(jié)果與帥紅霞、王志峰等［12－13］的報(bào)道相似。相比正常甲狀腺組織以及良性甲狀腺病變組織，TC 中NIS表達(dá)減弱，表明其攝碘能力降低，這也許可以解釋為什么臨床上對(duì)DTC轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行放射性碘治療前必須做甲狀腺全切及“清甲”治療［17］。從另一方面來(lái)看，本研究表明NIS mRNA定量值也許可以作為判斷良惡性甲狀腺疾病的參考指標(biāo)。

此外，本研究首次探討了NIS mRNA表達(dá)水平與TC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示NIS mRNA表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小以及腫瘤組織學(xué)類(lèi)型無(wú)關(guān)，但NIS mRNA表達(dá)與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤臨床AJCC分期密切相關(guān)。這些結(jié)果可能表明NIS表達(dá)量低的TC更有可能發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，NIS可能參與調(diào)控TC的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程。因此，NIS可能具有一定的預(yù)測(cè)TC轉(zhuǎn)移以及判斷TC預(yù)后的指標(biāo)。

另一方面，我們關(guān)于NIS差異化表達(dá)的研究結(jié)果也可以進(jìn)一步解釋為什么TC伴發(fā)轉(zhuǎn)移患者中有大約2/3的病例會(huì)出現(xiàn)對(duì)131碘治療的抵抗。分析其原因可能是伴發(fā)轉(zhuǎn)移的TC組織NIS表達(dá)降低，從而使得腫瘤組織的攝碘能力下降，從而進(jìn)一步出現(xiàn)放射性碘治療抵抗。因此針對(duì)放射性碘抵抗的患者，如果對(duì)NIS基因轉(zhuǎn)染失分化的和NIS低表達(dá)的TC細(xì)胞株進(jìn)行分子基因轉(zhuǎn)染，增加腫瘤細(xì)胞NIS表達(dá)，從而增強(qiáng)其攝取碘的能力，也可能為DTC提供一項(xiàng)新的分子治療手段。

綜上所述，我們的研究結(jié)果證實(shí)了NIS mRNA 在DTC組織中的差異化表達(dá)，NIS轉(zhuǎn)錄表達(dá)與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤臨床AJCC分期密切相關(guān)。NIS表達(dá)差異可能決定了放射碘治療的臨床效果和敏感性。通過(guò)對(duì)其N(xiāo)IS的表達(dá)進(jìn)行定量分析，可為DTC個(gè)性化放射性碘治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和指導(dǎo)，幫助提高131碘核素內(nèi)照射治療的療效和敏感性。

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（編輯 韓維棟）

Expression of sodium iodide symporter mRNA and its clinical significance in differentiated thyroid carcinoma

XU Jian－lin1，LIANG Xiao－yan2，NAN Yong－gang1，ZHAO Hua3，SHI Chang－bei1
（1.Department of Nuclear Medicine，Shaanxi Provincial Tumor Hospital，Xi’an 710061；2.Department of Radiology，Shaanxi Provincial People’s Hospital，Xi’an 710068；3.Department of Head and Neck，Shaanxi Provincial Tumor Hospital，Xi’an 710061，China）

Objective To investigate the expression of sodium iodide symporter（NIS）mRNA in differentiated thyroid Carcinoma（DTC）and further explore its value in clinical diagnosis and therapy of DTC.Methods The expression of NIS mRNA was detected and analyzed in 21 nodular goiter and 45 cases of DTC （including 35 cases of papillary thyroid carcinoma and 10 cases of follicular thyroid carcinoma）by using real－time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（real－time RT－PCR）.Results Compared with that in nodular goiter，the mRNA expression of NIS in DTC tissue was significantly decreased（P＜0.05）.Moreover，the mRNA expression of NIS was significantly correlated with lymph node metastasis and AJCC stage，respectively.The expression of NIS mRNA in DTC with lymph node metastasis was significantly decreased compared with that in DTC without lymph node metastasis（P＜0.05）.In addition，the expression of NIS mRNA inⅡ－Ⅳstage DTC was significantly decreased compared with that inⅠ－Ⅱstage DTC（P＜0.05）.Conclusion Differential expression of NIS can provide evidence for individual131I therapy for DTC.

differentiated thyroid carcinoma（DTC）；sodium iodide symporter（NIS）；OPN；131I therapy；real－time RT－PCR

R736.1

A

10.7652/jdyxb201602023

2015－02－06

2015－06－24

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014K11－01－02－16）Supported by the Science and Technology Project of Shaanxi Province（No.2014K11－01－02－16）

許建林.E－mail：xujianlin1973@126.com

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160124.1221.002.html（2016－01－24）