張 偉，許 靜，湯小江，王 婷，何建軍，施秉銀，王惠芳，王麗君

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.乳腺外科；2.內(nèi)分泌科；3.心內(nèi)科，陜西西安 710061）

大鼠急性心肌梗死模型建立的影響因素

張 偉1，許 靜2，湯小江1，王 婷3，何建軍1，施秉銀2，王惠芳2，王麗君3

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.乳腺外科；2.內(nèi)分泌科；3.心內(nèi)科，陜西西安 710061）

目的 探討在非人工通氣條件下體質(zhì)量、胸廓前后徑與左右徑的比例對大鼠急性心肌梗死（AMI）模型建立的影響以及梗死后左室功能的變化。方法 按體質(zhì)量將SD大鼠隨機分為4組：A組30只（200～250g），B組90只（250 ～300g），C組60只（＞300g）及D組20只（假手術(shù)組）。在非人工通氣條件下，測量胸廓徑線后，通過開胸結(jié)扎左冠狀動脈前降支（LAD）建立心肌梗死模型；同時記錄心電圖變化，觀察并測量AMI術(shù)后2周、4周的心室壁厚度、室壁運動情況及心臟功能的變化。術(shù)后2周開胸，觀察心臟大體形態(tài)的改變；同時取心臟標(biāo)本行HE染色并觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)。以上數(shù)據(jù)通過SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。結(jié)果 ①經(jīng)過30次實驗后成功建立第1只大鼠AMI模型，100次實驗后成模率逐漸穩(wěn)定在83％左右；②與A組比較，B組、C組大鼠AMI成模率較高（P＜0.05），B組、C組成模率無差異（P＞0.05）；③未發(fā)現(xiàn)大鼠胸廓的前后徑與左右徑的比值與成模率有相關(guān)性（P＞0.05）；④術(shù)后2周開胸，見缺血區(qū)心肌顏色發(fā)白，室壁運動減弱。HE染色及電鏡下可見心肌細(xì)胞丟失溶解，心肌結(jié)構(gòu)不完整，肌絲斷裂，大量纖維及膠原組織增生，線粒體染色變深，嵴模糊、水腫；⑤與D組相比，心梗組術(shù)后2周、4周的左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）和左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）增加（P＜0.05），左心室射血分?jǐn)?shù)（EF值）和心率下降（P＜0.05）。結(jié)論本方法可以成功建立大鼠AMI模型并出現(xiàn)心功能的改變；大鼠體質(zhì)量是在非人工通氣條件下建立AMI模型的重要因素，而胸廓的徑線對模型成功率的影響還需進一步證實。

體質(zhì)量；胸廓徑線；非人工通氣；心肌梗死；動物模型；左室功能

心肌梗死是威脅人類生命的重大疾病，而目前研究人類心肌梗死的病理、診斷及治療的重要手段主要是通過心肌梗死動物模型的建立與應(yīng)用。因此，模型的存活時間、可重復(fù)性及穩(wěn)定性對于心肌梗死的基礎(chǔ)研究有著重要的應(yīng)用價值［1］。因為大鼠的冠狀動脈系統(tǒng)側(cè)支循環(huán)較少、變異性低、同時相對穩(wěn)定，所以是冠脈疾病模型制備及研究的良好動物模型來源［2－4］。目前，此模型的制備較多采用操作復(fù)雜、損傷大、耗時長的剪斷胸骨或肋骨和氣管插管呼吸機輔助正壓通氣開胸的方法，影響模型存活率。目前已有文獻［5］提出了在非人工通氣條件下即不采用氣管插管呼吸機輔助通氣的方法建立大鼠AMI動物模型的方法，但未分析大鼠體質(zhì)量、胸廓徑線對模型成模率的影響。故本研究通過測量大鼠體質(zhì)量、胸廓前后徑，并計算出前后徑的比例，來研究其對非人工通氣下大鼠AMI模型成功率的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠200只，體質(zhì)量200～400g（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），所有動物符合動物美國NIH發(fā)布的實驗動物應(yīng)用、保護指南和實驗管理條例，已得到動物實驗管理委員會的批準(zhǔn)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 儀器與試劑 透射電鏡（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供），BL－420生物機能實驗系統(tǒng)（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科實驗室提供），多功能超聲診斷儀（Philips），烏拉坦（西安化學(xué)試劑廠）；游標(biāo)卡尺、稱重儀、手術(shù)刀、剪子、鑷子、手術(shù)縫合針、縫合線、碘伏和乙醇（購于西安化學(xué)試劑廠）等。

1.3 動物分組 所有SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按體質(zhì)量隨機分為4組：A組30只（200～250g），B組90只（250～300g），組為C組60只（300～400g）及D組20只（假手術(shù)組）。

1.4 模型的建立 大鼠稱重后，200g/L烏拉坦以0.7mL/100g的劑量腹腔注射麻醉。固定于手術(shù)臺上，由助手在第4肋水平測量胸廓前后徑以及左右徑并記錄數(shù)值。常規(guī)術(shù)區(qū)備皮、消毒、鋪巾，同時連通生理記錄儀，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，大鼠開放氣道后，在非人工通氣狀態(tài)下，于胸骨左緣第4肋間剪開皮膚，充分暴露術(shù)野，鈍性分離胸大肌和前鋸肌。術(shù)者用止血鉗沿胸骨左緣第4肋間穿入胸腔，迅速分離肋間肌并撐開肋骨，露出心臟。助手將右手食指置于左肋弓緣下，左手拇指與食指、中指置于兩側(cè)胸部，并適當(dāng)持續(xù)用力快速擠出心臟；術(shù)者于左心耳與肺動脈圓錐交界處平左心耳下緣2mm處，用6－0無損傷縫合線將左冠狀動脈前降支（left anterior descending coronary artery，LAD）近端結(jié)扎。進針深度約為1.5mm，結(jié)扎后立即將心臟放回，排出胸腔內(nèi)氣體，立即行心外按壓。觀察呼吸平穩(wěn)、心電圖心律正常后，縫合皮膚。肌肉注射青霉素鈉10萬單位，連續(xù)3d，用于預(yù)防感染。術(shù)后保暖，大鼠左側(cè)臥位，保持呼吸道通暢，防止舌后墜，保持飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生，保證飼料充足。假手術(shù)組只掛線不接扎。成模率的計算：成模率（％）＝單次手術(shù)成模的個數(shù)/單次手術(shù)個數(shù)的總數(shù)×100％。

1.5 心電圖的監(jiān)測 采用BL－420生物機能實驗系統(tǒng)動態(tài)記錄肢體標(biāo)Ⅱ?qū)?lián)心電圖變化。

1.6 心臟超聲監(jiān)測 大鼠AMI后2周、4周，再次用200g/L烏拉坦以0.6mL/100g行腹腔注射麻醉，并進行固定。由有小動物超聲檢查經(jīng)驗的超聲科醫(yī)師用Philips多功能超聲診斷儀進行大鼠心臟超聲檢查并觀察、記錄室壁運動以及心室壁厚度情況。同時測量術(shù)后2周、4周左室舒張末內(nèi)徑（LVEDd）、左室收縮末內(nèi)徑（LVESd）、左室射血分?jǐn)?shù)（EF，％）及心率（HR）的變化。

1.7 心臟大體形態(tài)及心肌組織病理學(xué)觀察 大鼠AMI后2周再次開胸，觀察LAD供血區(qū)的梗死面積、室壁顏色變化、搏動幅度。處死10只大鼠，取出心臟，觀察梗死區(qū)心室壁厚度變化；同時行HE染色觀察心肌組織病理學(xué)改變。

1.8 超微結(jié)構(gòu)的觀察 取同一心梗部位組織，常規(guī)處理后，應(yīng)用透射電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計處理。成模與成模率直接計算得出，其他結(jié)果以（珔x±s）表示。成模率與胸廓的前后徑與左右徑比值的相關(guān)性采用線性相關(guān)分析，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，配對數(shù)據(jù)采用χ2檢驗進行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型成模率分析 200只健康SD大鼠進行手術(shù)（包括假手術(shù)組20只），125只成功并存活。8只因血管變異結(jié)扎部位不確切而未成功；30只因發(fā)生嚴(yán)重氣胸以及縱膈擺動死亡；2只大鼠在手術(shù)前因麻醉劑過量死亡；10只因術(shù)后出現(xiàn)室速和（或）室顫而死亡；5只損傷肺臟死于呼吸衰竭。

2.2 AMI大鼠成模曲線圖 本實驗第1只大鼠急性心梗模型成功在30只后成功，成模率逐漸提高，于100只大鼠后成模率逐漸穩(wěn)定在83％左右（圖1）。每次實驗大鼠數(shù)大約為10只。

圖1 大鼠成模率曲線圖Fig.1The curve of modeling success rate

2.3 大鼠體質(zhì)量、胸廓各徑線與AMI成模率的關(guān)系在體質(zhì)量方面，與A組比較，B組以及C組大鼠成模率增高（P＜0.01）。B組與C組比較，成模率無差異（P＞0.05），B組與C組大鼠胸廓的前后徑與左右徑比值在1.08左右，但進一步進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，A、B、C三組中成模率與胸廓的前后徑與左右徑比值之間無相關(guān)性（P＞0.05，表1）。

表1 大鼠體質(zhì)量、胸廓各徑線與AMI成模率的關(guān)系Tab.1 Correlation between thoracic lines，rat weight and modeling success rate

2.4 模型建立后心電圖的改變 AD結(jié)扎后5min，生理記錄儀示Ⅱ?qū)?lián)心電圖呈現(xiàn)心率減慢，QRS波 R峰峰值減低，隨即出現(xiàn)ST段抬高和ST－T融合，大于0.3mV（圖2）。

圖2 心肌梗死后心電圖的變化Fig.2Changes of electrocardiogram after AMI

2.5 心臟大體形態(tài)及組織病理學(xué)的改變 大鼠AMI 后2周開胸，結(jié)扎的LAD支配區(qū)與周圍心肌形成明顯分界，此部位顏色發(fā)白，局部室壁運動減低或消失。心臟橫切面提示梗死區(qū)室壁明顯變薄，梗死區(qū)域纖維化，心室壁明顯變薄且成透亮白色。HE染色可見梗死區(qū)大量纖維及膠原組織增生，心肌細(xì)胞丟失殆盡，肌纖維排列紊亂，殘存的心肌結(jié)構(gòu)不完整，纖維組織增生，間質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞，肌絲斷裂（圖3）。

圖3 AMI模型2周心臟大體形態(tài)及組織病理學(xué)改變Fig.3General changes and pathological changes of the AMI model after 2weeks（HE，×100）

2.6 心肌超微結(jié)構(gòu)的變化 心梗后2周鏡下肌細(xì)胞內(nèi)局灶性肌纖維溶解、稀疏，線粒體染色變深，嵴模糊、水腫；4周鏡下見肌膜下水腫，線粒體嵴模糊，細(xì)胞核外水腫，肌絲溶解、斷裂，呈局灶性變性，間質(zhì)內(nèi)大量膠原纖維增生（圖4）。

2.7 心臟超聲結(jié)果 心梗組術(shù)后2周運動幅度可，左心室腔稍擴大；術(shù)后4周左心室腔較2周時擴大，運動幅度下降，室壁變薄；假手術(shù)組術(shù)后2周、4周左心室腔、運動幅度正常。與假手術(shù)組相比，兩組左室功能示，心梗組術(shù)后2周、4周的LVEDD和LVEDs增加（P＜0.05），EF值和心率下降（P＜0.01，P＜0.05，表2、圖5）。

圖4 心肌超微結(jié)構(gòu)的變化Fig.4Ultrastructural changes of cardiac muscles

表2 心梗后2周和4周心臟超聲的結(jié)果Tab.2 Echocardiographic results two weeks and four weeks after AMI

3 討論

心肌梗死動物模型的制作是研究人類心肌梗死病理、診斷及治療的重要手段之一。大鼠心梗模型的成功與否受到諸多因素影響，如大鼠的體質(zhì)量、麻醉藥物的種類以及劑量、手術(shù)者的熟練程度、術(shù)后的環(huán)境溫度以及濕度等。此模型的制備目前較多采用操作復(fù)雜、損傷大、耗時長的剪斷胸骨或肋骨和氣管插管呼吸機輔助正壓通氣開胸的方法［6－10］，影響模型存活率。結(jié)扎冠狀動脈是心肌梗死動物模型最主要的制作方法，它比電凝［11］、化學(xué)物誘導(dǎo)［12］、藥物誘導(dǎo)［13］、冷凍［14］等方法更符合臨床心肌梗死發(fā)生的病理改變。有研究認(rèn)為SD大鼠是建立心肌梗死模型的最佳動物材料［15］，因為它容易飼養(yǎng)、耐受性良好、經(jīng)濟投入低。

圖5 心肌梗死心臟超聲改變Fig.5Changes of echocardiographic after AMI

目前已有文獻提出了在非人工通氣條件下即不采用氣管插管呼吸機輔助通氣的方法建立大鼠AMI動物模型的方法［5］。研究我們發(fā)現(xiàn)大鼠急性心肌梗死模型建立的影響因素有麻醉藥物的種類、術(shù)者因素、大鼠的體質(zhì)量、胸廓前后徑與左右徑的比例以及術(shù)后護理、環(huán)境因素等有關(guān)。在非人工通氣條件下制作大鼠急性心肌梗死模型，該方法創(chuàng)傷小，出血少，快速、準(zhǔn)確定位，手術(shù)時間短，術(shù)后恢復(fù)快，感染的機會大大降低為后期實驗奠定基礎(chǔ)。

有文獻報道麻醉藥物的種類可以影響大鼠AMI模型的成功率［2］。多種麻醉藥如復(fù)合麻醉藥［16］、戊巴比妥［17］和氯胺酮等均可用于大鼠麻醉，常用的麻醉藥物還有烏拉坦以及水合氯醛。研究發(fā)現(xiàn)，水合氯醛可引起大鼠心律失常，干擾研究結(jié)果［2］。本研究采用200g/L烏拉坦以0.7mL/100g腹腔注射，注射途徑方便，其價格便宜，注射后10min左右起效，麻醉深度適中，術(shù)后蘇醒以及自主呼吸恢復(fù)快，是較理想的大鼠麻醉藥物。再者模型制備成功的影響因素還有手術(shù)環(huán)境及溫濕度控制，本實驗中溫度控制在25～27℃之間、相對濕度為50％左右，與李秋菊等報道相一致［18］。

人類研究疾病模型的制備至關(guān)重要，現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)研究更離不開動物實驗，AMI模型制備與手術(shù)者的熟練程度、手術(shù)技巧、精細(xì)操作的能力，對大鼠心臟血管的解刨位置的熟悉程度以及環(huán)境、大鼠的個體差異等等均有關(guān)系。繪制的學(xué)習(xí)曲線顯示本實驗第1只大鼠急性心梗模型成功在30只后成功，成模率逐漸提高，于100只大鼠后成模率逐漸穩(wěn)定在83％左右，從學(xué)習(xí)曲線中，我們體會到制作大鼠AMI模型過程亦是一個逐漸熟練，循序漸進以及對模型掌握程度逐漸提高的過程。

體質(zhì)量在AMI模型建立中起到非常重要的作用。本研究中，A組大鼠體質(zhì)量最低，其與B組、C組相比，A組大鼠模型成功率明顯較低（P＜0.05），此結(jié)果與國內(nèi)部分結(jié)果相似［5］。分析原因可能與大鼠體質(zhì)量小，對手術(shù)以及麻醉耐受力差有關(guān)；再者大鼠體質(zhì)量小，心臟血管發(fā)育不完備，血管纖細(xì)，解刨位置不明顯，結(jié)扎難度高亦影響成模率。本研究還顯示，B組及C組大鼠體質(zhì)量均較大，成模率均較高，兩組間無統(tǒng)計學(xué)的差異（P＞0.05），此結(jié)果與國內(nèi)文獻報道存在差異［17］?？赡茉颍孩倥c300g以上大鼠造模數(shù)量不同有關(guān)；②與手術(shù)技巧、精細(xì)操作的能力，對大鼠心臟血管的解刨位置的熟悉程度以及環(huán)境、大鼠的個體差異等等均有關(guān)系。③與術(shù)者和助手的配合程度有關(guān)。

目前，尚未檢索到關(guān)于SD大鼠胸廓前后徑與左右徑的比例對模型成功率的影響。本研究中，成模率較高的兩組中大鼠胸廓前后徑與左右徑的比例在1.08，且在體質(zhì)量較大的大鼠中（體質(zhì)量在300g以上的C組）亦有較高的成功率，但進行統(tǒng)計學(xué)分析無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。因此，胸廓徑線可能不是影響模型成功率的重要因素。關(guān)于二者之間的相關(guān)性仍需進一步證實。

正常的心肌組織顯示心肌細(xì)胞形態(tài)完整，界限分明，胞漿中橫紋肌清晰可見，細(xì)胞核呈橢圓形。本實驗中，在成模后2周、4周再次開胸，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)扎的LAD支配區(qū)與周圍心肌形成明顯分界，此部位顏色發(fā)白，局部室壁運動減低或消失。HE染色可見梗死區(qū)大量纖維及膠原組織增生，心肌細(xì)胞丟失殆盡，肌纖維排列紊亂，殘存的心肌結(jié)構(gòu)不完整，纖維組織增生，間質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞，肌絲斷裂。電鏡下可見心梗后2周肌細(xì)胞內(nèi)局灶性肌纖維溶解、稀疏，線粒體染色變深，嵴模糊、水腫；心梗后4周肌膜下水腫，線粒體嵴模糊，細(xì)胞核外水腫，肌絲溶解、斷裂，呈局灶性變性，間質(zhì)內(nèi)大量膠原纖維增生，支持模型成功。

通過本實驗，我們發(fā)現(xiàn)在梗死后2周左心室腔稍擴大；術(shù)后4周左心室腔較前擴大，前壁變薄，運動幅度下降。與假手術(shù)組相比，心梗組術(shù)后2周、4周的LVEDd和LVESd增加（P＜0.05），EF值和心率下降（P＜0.05）。我們發(fā)現(xiàn)心梗組中大鼠心率減慢，與魏峰等［5］報道相一致。究其原因可能是心梗組大鼠行心臟超聲檢查時，處于麻醉狀態(tài)，故心率慢考慮與麻醉有關(guān)。我們的心梗模型術(shù)后2周即出現(xiàn)心功能的改變與國外相關(guān)報道相一致［19－21］。

綜上所述，本實驗方法可以成功建立大鼠AMI模型并出現(xiàn)心功能的改變；大鼠體質(zhì)量是在非人工通氣條件下建立AMI模型的重要因素，而胸廓的徑線對模型成功率的影響還需進一步證實。本研究通過總結(jié)親身的造模經(jīng)驗和方法，并通過體表心電圖、心臟超聲和病理染色、電鏡等方法進一步驗證了模型建立的高效性和穩(wěn)定性，同時觀察了心肌梗死后左室功能變化，為進一步有關(guān)心梗疾病的研究奠定了基礎(chǔ)，值得推廣應(yīng)用。

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（編輯 卓選鵬）

The influencing factors for establishing a model of acute myocardial infarction in rats

ZHANG Wei1，XU Jing2，TANG Xiao－jiang1，WANG Ting3，HE Jian－jun1，SHI Bing－yin2，WANG Hui－fang2，WANG Li－jun3
（1.Department of Breast Surgery；2.Department of Endocrinology；3.Department of Cardiology，the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）

Objective To study the effects of weight and anteroposterior diameter－to－transverse diameter ratio on establishing a model of acute myocardial infarction（AMI）in rats without artificial ventilation and changes in left ventricular function after infarction.Methods Healthy SD rats were randomly divided into group A（200－250 g），group B（250－300 g），group C（＞300 g），and group D（control group）.The left anterior descending （LAD）coronary artery was ligated to establish a model of myocardial infarction under spontaneous breathing condition immediately after thoracic lines were measured.And changes of electrocardiography were recorded after model establishment.At 2 and 4 weeks after AMI，we observed ventricular wall thickness and ventricular wall motion and measured the changes of cardiac function.Histomorphological changes and myocardial ultrastructure of the heart were observed under thoracotomy 2 weeks after operation.The above data were analyzed by SPSS13.0 statistics software.Results ①The first AMI rat model was established successfully after 30 times of experiments，and after 100 times the model’s success rate gradually stabilized at about 83％.②Group B and group C had a higher model success rate than group A（P＜0.05），but group B and group C did not differ in modeling success rate（P＞0.05）.③There was no association between the rate of rat thoracic line and modeling success rate（P＞0.05）.④Two weeks after thoracotomy，ischemic myocardial color was white，and ventricular wall motion decreased.HE staining revealed that cardiomyocytes disappeared and were replaced by fibrous tissues and collagen.Remnant cardiomyocytes were arranged disorderly and myofibers were fractured，with interstitial damage and hyperplasia of fibrous tissue.Visible muscle cells were sparse and dissolved，the mitochondria had darker staining，blurred cristae，and edema under electron microscopy.⑤Compared with group D，2 weeks and 4 weeks after myocardial infarction，left ventricular end－diastolic diameter（LVEDD）and left ventricular end systolic diameter（LVEDs）increased（P＜0.05），but EF values and heart rate dropped（P＜0.05）.Conclusion By this method，a model of AMI in rats can be established successfully and the heart function is changed.Under the condition of non－artificial ventilation，the weight of rats is an important factor for establishing AMI model.However，we have not confirmed the effect of thoracic lines on establishing AMI model yet.

weight；thoracic line；non－artificial ventilation；acute myocardial infarction；animal model；left ventricular function

R542.2

A

10.7652/jdyxb201602013

2015－07－22

2015－12－25

陜西省社會發(fā)展科技攻關(guān)項目資助（No.2015SF101）；西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院院基金資助（No.2014YK26）Supported by the Social Development of Technology Research Projects Foundation of Shaanxi Province（No.2015SF101）and the Foundation of the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University（No.2014YK26）

許靜.E－mail：254309205@qq.com

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160201.1840.002.html（2016－02－01）