何 珊，趙儷月，巴曉曄，王寶彥，宋建玲

（1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科，陜西西安 710004；2.廣州市第一人民醫(yī)院口腔科，廣東廣州 510180；3.西安高新醫(yī)院口腔科，陜西西安 710075；4.瑚西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院牙周黏膜科，陜西西安 710004）

苯妥英鈉對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF和SCF分泌的影響

何 珊1，趙儷月2，巴曉曄3，王寶彥4，宋建玲4

（1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科，陜西西安 710004；2.廣州市第一人民醫(yī)院口腔科，廣東廣州 510180；3.西安高新醫(yī)院口腔科，陜西西安 710075；4.瑚西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院牙周黏膜科，陜西西安 710004）

目的 研究苯妥英鈉（PHT）對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs）和血管內(nèi)皮細(xì)胞（rVECs）間接共培養(yǎng)體系中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）和干細(xì)胞因子（SCF）分泌的影響。方法 分別建立rBMSCs、rVECs單獨(dú)培養(yǎng)組及共培養(yǎng)組，各組添加不同質(zhì)量濃度的PHT（0、20、40μg/mL）。在培養(yǎng)第2、4、6天時，用雙抗體夾心ABC－ELISA法檢測培養(yǎng)上清中VEGF和SCF的含量。結(jié)果 ①VEGF：培養(yǎng)第二天時，在相同PHT作用下，共培養(yǎng)組VEGF含量高于rBMSCs單獨(dú)培養(yǎng)組（P＜0.05）和rVECs單獨(dú)培養(yǎng)組（P＜0.001）；共培養(yǎng)組隨著培養(yǎng)時間的延長和PHT濃度增大VEGF含量增加（P＜0.001，P＜0.05）。②SCF：共培養(yǎng)組SCF含量高于相同PHT濃度下的單獨(dú)培養(yǎng)組；在共培養(yǎng)組中，當(dāng)PHT為20μg/mL時，隨著培養(yǎng)時間延長SCF含量增加；當(dāng)PHT為40μg/mL時，隨著培養(yǎng)時間延長SCF含量減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 PHT可促進(jìn)rBMSCs與rVECs共培養(yǎng)體系中VEGF的分泌，可能降低SCF的分泌。

大鼠；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；血管內(nèi)皮細(xì)胞；間接共培養(yǎng)；血管新生；苯妥英鈉

目前，牙周損傷區(qū)再生修復(fù)的研究大多集中于干細(xì)胞向牙周各類成體細(xì)胞的增殖分化方面，對于血管新生方面的研究相對較少，而血管新生對促進(jìn)損傷區(qū)的再生修復(fù)非常重要。研究提示除了牙周局部的前體細(xì)胞外，來自骨髓和血液的間充質(zhì)細(xì)胞也可能參與損傷區(qū)的血管新生過程［1］。苯妥英鈉（phenytoin，PHT）除具有廣泛的生物學(xué)作用外，還可促進(jìn)多種細(xì)胞因子及生長因子的分泌［2］。本實驗旨在初步探究PHT對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs）和血管內(nèi)皮細(xì)胞（rat vascular endothelial cells，rVECs）共培養(yǎng)體系中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）分泌的影響，以進(jìn)一步了解PHT在牙周組織血管新生中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠4只，雄性，體質(zhì)量150g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供；ATCCEC，由上海拜力生物有限公司提供。

1.2 主要試劑和儀器 FactorⅧrelated antigen （AbD，英國）；兔免疫組化試劑盒（四正柏生物科技，中國）；免疫熒光試劑盒（北京博奧森）；Transwell懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)小室（Corning，美國）；HF240型細(xì)胞培養(yǎng)箱、TE2000－S型倒置相差顯微鏡（Nikon，日本）；透射電鏡（奧林巴斯，日本）

1.3 方法

1.3.1 rBMSCs原代獲取、傳代培養(yǎng)和鑒定 rBMSCs獲取及培養(yǎng)：將大鼠麻醉后處死，浸泡于750 mL/L乙醇消毒，在超凈臺分離其雙側(cè)股骨及脛骨，剪破干骺端用DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，將所得細(xì)胞懸液制成單細(xì)胞懸液，離心后棄上清，加入適量含有150mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，將細(xì)胞沉淀混勻后接種到培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱。48h后首次換液，之后每隔3d換液1次。待細(xì)胞長滿瓶底80％～90％后消化傳代，以1∶2的比例接種至新培養(yǎng)瓶中。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況，取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

rBMSCs鑒定：采用成骨誘導(dǎo)液對第三代rBMSCs進(jìn)行為期28d的誘導(dǎo)培養(yǎng)后進(jìn)行茜素紅染色；用成脂誘導(dǎo)液對第三代細(xì)胞誘導(dǎo)14d后進(jìn)行油紅“O”染色；MTT法繪制rBMSCs生長曲線。

1.3.2 rVECs傳代培養(yǎng)和鑒定 rVECs傳代培養(yǎng)：從培養(yǎng)箱中取出第二代rVECs，PBS液反復(fù)清洗2～3遍后，加入1～3mL 2.5g/L胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液反復(fù)離心3次后用含100mL/L FBS的1640培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，再以1∶3～1∶5比例傳代，記做第三代。

rVECs鑒定：細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生長特性觀察；蘇木素－伊紅（hematoxylin and eosin staining，HE）染色；免疫熒光檢測vWF；透射電鏡觀察特殊結(jié)構(gòu)Weibel－Palade（W－P）小體。

1.3.3 實驗分組 取生長狀態(tài)良好的第三代rBMSCs和第四代rVECs用于實驗。實驗分為3組：①rBMSCs單獨(dú)培養(yǎng)組：rBMSCs以5×105個/孔接種于6孔板中。②rVECs單獨(dú)培養(yǎng)組：rVECs以5× 104個/孔接種于6孔板中。③間接共培養(yǎng)組：rBMSCs接種于Transwell外室中，rVECs接種于相配套的Transwell內(nèi)室共培養(yǎng)。各組分別添加質(zhì)量濃度為0、20、40μg/mL的PHT進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.4 ELISA檢測SCF和VEGF 分別于間接共培養(yǎng)的第2、4、6天用EP管收集共培養(yǎng)組和單獨(dú)培養(yǎng)組上清液各1mL，－70℃凍存，備用。

分別將抗大鼠SCF和VEGF單抗包被在酶標(biāo)板上，使標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的SCF和VEGF與各自的單抗相結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠SCF和VEGF，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，最后加終止液硫酸，在450nm處測A值。VEGF和SCF濃度分別與A值成正比，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)分析 各組實驗均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行多因素方差分析（Multivariate analysis of variance），可信區(qū)間為95％，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rBMSCs鑒定

2.1.1 多向分化潛能 成骨誘導(dǎo)：用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)rBMSCs 28d時胞質(zhì)內(nèi)外出現(xiàn)許多細(xì)小的黑色顆粒，胞核顏色較胞質(zhì)顏色淺。茜素紅染色見鈣化結(jié)節(jié)，證實所培養(yǎng)細(xì)胞具有成骨分化的潛能。對照組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)未見明顯鈣化結(jié)節(jié)（圖1）。

圖1 rBMSCs成骨誘導(dǎo)鑒定結(jié)果Fig.1Identification osteodifferentiation of rBMSCs（×100）

成脂誘導(dǎo)：用成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)rBMSCs第3天，少量細(xì)胞由長梭形變?yōu)槁褕A形，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色折射性較強(qiáng)之類圓形小脂滴。誘導(dǎo)至第14天時大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生類圓形改變。油紅“O”染色見誘導(dǎo)的細(xì)胞呈類圓形，脂滴散布在胞漿內(nèi)，證實所培養(yǎng)的細(xì)胞具有成脂肪分化的潛能（圖2）。

圖2 rBMSCs成脂誘導(dǎo)鑒定結(jié)果Fig.2Identification adipogenesis of rBMSCs（×200）A：誘導(dǎo)組；B：對照組。

2.1.2 細(xì)胞生長曲線 rBMSCs的生長曲線（圖3）顯示：培養(yǎng)1～2d時細(xì)胞增殖速度較為緩慢，屬于潛伏期；3～5d細(xì)胞生長迅速，進(jìn)入對數(shù)生長期；6～7d細(xì)胞增殖緩慢，進(jìn)入平臺期。曲線呈橫“S”型。

圖3 rBMSCs生長曲線Fig.3The growth curve of rBMSCs

2.2 rVECs鑒定

2.2.1 HE染色 在細(xì)胞聚集區(qū)，rVECs呈典型的多角形，“鵝卵石”樣緊密排列；在細(xì)胞稀疏區(qū)，部分細(xì)胞呈長梭形貼壁生長（圖4）。

圖4 rVECs HE染色Fig.4 Hematoxylin－eosin staining of vascular endothelial cells in rats（×40）

2.2.2 免疫熒光檢測vWF Rhodamine熒光染色（圖5）顯示：細(xì)胞呈鋪路石樣結(jié)構(gòu)排列。胞質(zhì)均染上紅色熒光，核周尤為明顯，細(xì)胞輪廓較清晰。

圖5 rVECs免疫熒光檢測vWFFig.5vWF in vascular endothelial cells by immunofluorescence（×200）

2.2.3 透射電鏡觀察W－P小體 透射電鏡下可見rVECs邊緣有較多的絨毛狀突起，胞質(zhì)內(nèi)有溶酶體、次級溶酶體等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可見內(nèi)皮細(xì)胞最具特征性的短棒狀W－P小體，其橫徑220～225nm，呈類圓形或“L”形，電子密度高，內(nèi)見管狀結(jié)構(gòu)規(guī)則排列；細(xì)胞核呈卵圓形、橢圓形或不規(guī)則形態(tài)，大多位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)均勻，核仁1 ～2個，在核周圍的胞質(zhì)內(nèi)可見較多的質(zhì)膜小泡（圖6）。

2.3 VEGF和SCF含量 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：每個樣品設(shè)3個孔，酶標(biāo)儀檢測波長為450nm時的A值，以樣品所對應(yīng)的含量為曲線縱軸，A為橫軸。得到A值為Y、樣品含量值為X的方程。

圖6 透射電鏡觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞中的W－P小體。Fig.6W－P body in endothelial cells by TEM（×100 000）箭頭所指為不同形態(tài)的W－P小體。

2.3.1 VEGF含量 在培養(yǎng)第二天時，共培養(yǎng)組中VEGF的含量均高于相同濃度PHT作用下的單獨(dú)培養(yǎng)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中共培養(yǎng)組與rVECs組相比有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖7A）。提示將rVECs與rBMSCs共培養(yǎng)之后，VEGF的分泌增加。而共培養(yǎng)組中VEGF的含量隨著培養(yǎng)時間延長而遞增，培養(yǎng)第2、4和6天時VEGF含量相比均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），其中共培養(yǎng)組PHT為40μg/mL在培養(yǎng)第6天時VEGF的含量高于第2、4天，與20μg/mL組相比也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖7B）。提示PHT質(zhì)量濃度為40μg/mL時，隨著培養(yǎng)時間的延長共培養(yǎng)組中VEGF的分泌增加。

圖7 ELISA檢測各組VEGF含量Fig.7VEGF content in each group by ELISA

2.3.2 SCF含量 在無PHT干預(yù)時，rBMSCs組SCF含量高于其他兩組。而加入不同濃度的PHT后，共培養(yǎng)組中SCF含量高于其他兩組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖8A）。共培養(yǎng)組PHT濃度為20μg/mL時，SCF的含量隨著培養(yǎng)時間的延長而遞增，在培養(yǎng)第6天時高于第2、4天；而當(dāng)PHT濃度為40μg/mL時，共培養(yǎng)組中SCF的含量隨著培養(yǎng)時間的延長而減少，各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖8B）。提示隨著共培養(yǎng)時間的延長和PHT濃度增加，rBMSCs可能出現(xiàn)了向rVECs的分化。

圖8 ELISA檢測各組SCF含量Fig.8SCF content in each group by ELISA

3 討論

PHT作為一種經(jīng)典的抗癲癇類藥物，自1938年以來被廣泛用于治療神經(jīng)系統(tǒng)及心血管疾病。在口腔方面，長期應(yīng)用PHT能夠引起藥物性牙齦增生；研究證實PHT能促進(jìn)與牙周軟、硬組織修復(fù)再生所需的多種生長因子分泌，而這些因子又與血管新生密切相關(guān)。因此本實驗擬觀察在組織修復(fù)血管新生時，苯妥英鈉對干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的影響。

目前，常用條件培養(yǎng)基對干細(xì)胞誘導(dǎo)分化。在BMSCs向VECs分化的研究中，應(yīng)用較多的有內(nèi)皮細(xì)胞條件誘導(dǎo)液，其中添加一定比例的VEGF、bFGF或促血管生成素－1等生長因子，以此刺激、誘導(dǎo)BMSCs的定向分化［3－4］，然而此類方法僅能為干細(xì)胞提供分化環(huán)境中較為單一的一類或幾類因子。由于血管內(nèi)皮細(xì)胞可分泌、合成多種生物活性物質(zhì)［5］，因此相較于條件培養(yǎng)液來說，若將兩種細(xì)胞進(jìn)行間接共培養(yǎng)，從一定程度上可以模擬出更接近體內(nèi)的、同時有多種生長因子存在的局部環(huán)境。本實驗所采用的細(xì)胞間接共培養(yǎng)技術(shù)［6］借由一層孔徑為0.4μm的聚碳脂薄膜隔絕了兩種細(xì)胞間的直接接觸，而使兩種細(xì)胞處于同一培養(yǎng)環(huán)境下，PHT對共培養(yǎng)后rBMSCs和rVECs分化的影響得以更好地顯現(xiàn)。我們通過ELISA法檢測培養(yǎng)上清中VEGF和SCF的含量來觀察PHT的這種影響。

VEGF是目前研究最為廣泛的血管通透因子，它在不同時期促進(jìn)血管生成的作用不同。在胚胎早期，它對血管新生十分重要［7］，能夠促進(jìn)VECS的遷移、增殖、管腔樣結(jié)構(gòu)的形成并提高細(xì)胞的存活率。這一作用已被證實與MAPK家族中P38MAPK［8］及MEK/ERK［9］通路相關(guān)；而在機(jī)體成熟后，參與維持生理狀態(tài)下的血管結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)病理性的血管新生［10］。在本實驗中隨著培養(yǎng)時間的延長，VEGF含量的改變與PHT濃度呈現(xiàn)出正相關(guān)的趨勢。這一結(jié)果提示：PHT可促進(jìn)VEGF的分泌，而VEGF增多，使共培養(yǎng)的局部微環(huán)境與內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基中成分類似，因而在此環(huán)境中可能會誘導(dǎo)rBMSCs向rVECs的分化。這與OKUYAMA等［11］提出的局部微環(huán)境促進(jìn)BMSCs表面的VEGF分泌增多后又可誘導(dǎo)BMSCs分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的結(jié)論一致。

SCF來源于骨髓微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞，通過和酪氨酸激酶受體結(jié)合來刺激細(xì)胞的遷移、黏附，也可促進(jìn)干細(xì)胞分裂，抑制細(xì)胞凋亡。程鵬等［12］證明了SCF在體外可趨化BMSCs發(fā)生定向遷移，這一過程與絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)通路中的p38MAPK通路相關(guān)。王蕾等［13］發(fā)現(xiàn)復(fù)合了SCF的凝膠在大鼠骨創(chuàng)傷組織的愈合過程中發(fā)揮著促進(jìn)成血管和成骨的作用，加速愈合進(jìn)程。本實驗中SCF含量的檢測結(jié)果顯示：在沒有PHT的干預(yù)下，rBMSCs中SCF的分泌量隨著培養(yǎng)時間的延長而減少，提示在正常的共培養(yǎng)環(huán)境中，隨著培養(yǎng)時間的延長rBMSCs可能出現(xiàn)了定向分化，其干細(xì)胞性逐漸減弱。而在PHT濃度為20μg/mL時，共培養(yǎng)組中SCF分泌量隨著培養(yǎng)時間延長出現(xiàn)了增多趨勢。但這一趨勢不明顯，這也許與樣本量及SCF分泌量較少有關(guān)。而在PHT濃度為40μg/mL時，共培養(yǎng)組中SCF含量隨著培養(yǎng)時間延長而減少，這一現(xiàn)象與AZHAR［14］、KIZU［15］和KALLURI等［16］早前研究發(fā)現(xiàn)的在一定情況下VECs可轉(zhuǎn)分化為間充質(zhì)樣干細(xì)胞的結(jié)果一致。本實驗結(jié)果提示：①PHT在誘導(dǎo)rBMSCs發(fā)生定向分化的同時，可能在一定程度上誘發(fā)了rVECs向rBMSCs的轉(zhuǎn)分化，這種轉(zhuǎn)分化又為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一定時間內(nèi)保持干細(xì)胞性提供了可能；②20μg/mL的PHT相較于40μg/mL的PHT更能誘發(fā)這一情況的發(fā)生。溫麗等［17］將內(nèi)皮祖細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞間接培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，BMSCs的干細(xì)胞性并未發(fā)生明顯改變。結(jié)合我們的實驗結(jié)果分析，這種情況的出現(xiàn)可能是由于作為成體細(xì)胞的VECs可分泌某些特殊的生長因子，如VEGF、SCF等，而這類生長因子在內(nèi)皮祖細(xì)胞中表達(dá)甚少。

綜上所述，PHT在共培養(yǎng)體系中既能促進(jìn)rBMSCs向rVECs定向分化，還可能誘發(fā)rVECs向rBMSCs轉(zhuǎn)分化。而這些作用具體是如何實現(xiàn)的還需要更進(jìn)一步研究探索。

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Effects of phenytoin on VEGF and SCF in rat bone marrow mesenchymal stem cells and vascular endothelial cells co－culture system

HE Shan1，ZHAO Li－yue2，BA Xiao－ye3，WANG Bao－yan4，SONG Jian－ling4
（1.Department of Oral Medicine，the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710004；2.Department of Oral Medicine，the First Municipal People’s Hospital，Guangzhou 510180；3.Department of Oral Medicine，Xi’an Gaoxin Hospital，Xi’an 710075；4.Department of Periodontal Membrane，School of Stomatology of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710004，China）

Objective To investigate the effects of phenytoin（PHT）on the secretion of vascular endothelial growth factor（VEGF）and stem cell factor（SCF）based on the establishment of indirect co－culture system of rat bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）and vascular endothelial cells（VECs）.Methods Indirect coculture model of rat BMSCs and VECs was established.Experimental groups：indirect co－culture groups（PHT concentrations were 0，20 and 40μg/mL）；the control group：BMSCs culture group and VECs culture group（PHT concentrations were 0，20 and40μg/mL）.The contents of VEGF and SCF in the culture supernatant were measured using double antibody sandwich ABC－ELISA method on cultivation days 2，4，6.Results ELISA assay of the rBMSCs and rVECs in indirect co－culture supernatants，collected on culture days 2，4 and6 showed that：①VEGF：On culture day 2，VEGF level in the co－culture groups was significantly higher than those in BMSCs group（P＜0.05）and rVECs group（P＜0.001）.As culture time prolonged and PHT concentration increased to 20μg/mL and 40μg/mL，VEGF level increased too（P＜0.001，P＜0.05）.②SCF testing results showed that the secretion of SCF in co－culture groups was higher than that in the control groups.When PHT was 20μg/mL，the secretion of SCF increased as the incubation time increased；but as the incubation time increased，PHT concentration of 40μg/mL made SCF content decrease.Each group did not significantly differ（P＞0.05）.Conclusion PHT promotes the secretion of VEGF and may reduce the secretion of SCF.

rat；bone marrow mesenchymal stem cells（rBMSCs）；vascular endothelial cells（rVECs）；indirect co－culture；angiogenesis；phenytoin（PHT）

R784.1

A

10.7652/jdyxb201602012

2015－06－24

2015－11－16

陜西省科技廳社發(fā)攻關(guān)資助項目（No.2012SF2－22）Supported by the Social Development Project of Science and Technology Department of Shaanxi Province（No.2012SF2－22）

王寶彥.E－mail：baoyan@mail.xjtu.edu.cn

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160124.1900.008.html（2016－01－24）