劉軍俠，劉全超，姜文虎，宋曉英，高寶嘉，*

1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，保定　0710002河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保定　071000

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草履蚧不同寄主和地理種群遺傳分化的RAPD分析

劉軍俠1，2，劉全超1，姜文虎1，宋曉英1，高寶嘉1，2，*

1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，保定071000
2河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保定071000

摘要:應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)對(duì)草履蚧保定、石家莊、邯鄲16個(gè)不同寄主地理種群遺傳多樣性和種群分化進(jìn)行研究，結(jié)果顯示4個(gè)RAPD引物共擴(kuò)增出41個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)比率為100％。遺傳距離指數(shù)在0.701—0.4360，平均為0.2395。其中以邯鄲楓楊和邯鄲垂絲海棠為寄主的草履蚧種群遺傳距離最小(0.0701);以石家莊紫葉李和邯鄲木槿為寄主的種群遺傳距離最大(0.4360)。遺傳一致度系數(shù)在0.6466—0.9290。說明草履蚧不同種群遺傳多樣性豐富并存在遺傳差異。聚類分析結(jié)果表明草履蚧種群遺傳多樣性同時(shí)受到寄主和地理因素的雙重影響，且不同寄主草履蚧種群已產(chǎn)生明顯的遺傳分化。

關(guān)鍵詞:草履蚧;寄主植物;種群分化; RAPD

劉軍俠，劉全超，姜文虎，宋曉英，高寶嘉.草履蚧不同寄主和地理種群遺傳分化的RAPD分析.生態(tài)學(xué)報(bào)，2016，36(2): 298-305.

Liu J X，Liu Q C，Jiang W H，Song X Y，Gao B J.RAPD analysis of genetic differentiation in the different hosts and geographic populations of Drosicha corpulenta.Acta Ecologica Sinica，2016，36(2): 298-305.

隨著分子生物學(xué)發(fā)展，應(yīng)用分子系統(tǒng)分析的方法研究昆蟲種群分化和遺傳多樣性，從分子水平探討寄主、環(huán)境因子等對(duì)昆蟲適應(yīng)進(jìn)化的影響，以明確昆蟲適應(yīng)進(jìn)化的分子機(jī)制。蚧蟲作為一類營相對(duì)固定生活的刺吸類害蟲，呈聚集型空間分布，擴(kuò)散能力弱，其發(fā)生與寄主種群以及地理環(huán)境有著密切的關(guān)系［1-4］，在長期的系統(tǒng)發(fā)育中形成了相對(duì)穩(wěn)定的區(qū)系組成以適應(yīng)不同環(huán)境，不同的寄主種群、生態(tài)地理種群間差異明顯。高寶嘉等對(duì)皺大球蚧(Eulecanium kuwana i)和瘤堅(jiān)大球蚧(E.gigan tean)地理種群的RAPD遺傳分化的研究發(fā)現(xiàn)，已發(fā)生種內(nèi)遺傳變異，但尚未達(dá)到亞種水平［5］。Burban等通過對(duì)松干蚧的研究指出松干蚧種群變異與寄主植物的遺傳結(jié)構(gòu)有關(guān)［6］。本研究選取河北省不同草履蚧Drosicha corpulenta(kawana)種群，對(duì)其遺傳分化進(jìn)行RAPD分析，揭示寄主植物、地理環(huán)境等生態(tài)條件對(duì)蚧蟲遺傳分化的影響，為深入探討植物昆蟲協(xié)同進(jìn)化關(guān)系和昆蟲適應(yīng)潛力提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1供試?yán)ハx

2011年4—5月于保定、石家莊、邯鄲不同寄主上采集雌成蟲(表1)。不同寄主相距50m以上，每種寄主東、南、西、北方向的上、中、下部枝條分別取樣。將采集的蚧蟲饑餓24h以上，使其消化道內(nèi)的物質(zhì)充分消化，以防外源DNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果;－20℃冰箱中保存。

表1　供試草履蚧材料來源Table 1 Sources of D.corpulenta materials for trial

1.2主要試劑與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用的TaqDNA聚合酶、dNTP、蛋白酶K、RAPD引物、DNA標(biāo)記(DL2000)均由上海生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.3研究方法

1.3.1提取DNA

參照Boyce等的方法［7］，并做適當(dāng)修改。取1只蚧蟲于滅菌的研缽(每個(gè)種群取28個(gè)樣本)，加入液氮迅速研磨成粉末，放入1.5mL的離心管中，加入700μL預(yù)冷的2×CTAB(0.1mol/L Tris2-HCl，1.4mol/L NaCl，0.2mol/L EDTA，0.2％β巰基乙醇，0.05mol/L CT AB，pH8.3)，加入蛋白酶K至終濃度為100μg/mL，65℃下水浴1h，用12000r/min離心5min，取上清液，加入等體積得酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)輕輕混勻，反復(fù)抽提兩次。再經(jīng)等體積的異丙醇沉淀1h，4℃下10000r/min離心10min，去上清，70％的乙醇清洗1—2次，干燥后加入適量TE溶液溶解DNA，加入RNaesA至終濃度為2μg/L后，37℃下水浴1h，－20℃保存待用。

1.3.2 RAPD擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)篩選出4條可用引物，其引物名稱及序列見表2。參照Williams的方法［8］，反應(yīng)體系25μL，其中模板50ng，10×Buffer2.5μL，Mg2+114—210 mmol/L(因座位而異)，dNTP200μmol/L，引物(0.8μmol/L)，Taq酶1.5U反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性1min; 92℃變性1 min，37℃退火1 min(因座位而異)，72℃延伸2 min，45個(gè)循環(huán); 72℃再延伸10min; 4℃終止反應(yīng)。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠(含1％核酸顯色劑)分離，電泳緩沖液為0.5×TBE，上樣量為10μL。電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀拍照。

1.3.3數(shù)據(jù)分析

RAPD為顯性標(biāo)記，同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中遷移律相同的條帶被認(rèn)為是同源性的，屬于同一位點(diǎn)的條帶按清晰可見的強(qiáng)帶或反復(fù)出現(xiàn)的弱帶記為1，無帶記為0，形成二元數(shù)據(jù)。應(yīng)用Popstream32 和NTSYSpc2.1軟件，計(jì)算種群遺傳多樣性參數(shù)并根據(jù)遺傳相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA種群聚類分析。

表2　隨機(jī)引物編號(hào)及序列Table 2 RAPD primer codes and their sequences

2結(jié)果與分析

2.1遺傳多態(tài)位點(diǎn)分析

引物擴(kuò)增結(jié)果見圖1，不同種群遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)見表3。供試引物對(duì)16個(gè)種群448個(gè)個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增，共產(chǎn)生41條清晰、穩(wěn)定的片段，平均每條引物擴(kuò)增10.25條片段，各片斷分子量大小在200—2000bp之間，種群內(nèi)和種群間并未產(chǎn)生各自特征性帶譜。實(shí)驗(yàn)共檢測出41個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)比率為100％，說明草履蚧種群遺傳多樣性豐富。但不同種群的擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性結(jié)果不同，各種群多態(tài)位點(diǎn)比率在31.71％—63.41％之間，其中邯鄲紫薇寄主種群多態(tài)位點(diǎn)比率最低(31.71％)，邯鄲紫葉李寄主種群(63.41％)和邯鄲桑樹寄主種群(60.98％)多態(tài)位點(diǎn)最高，遺傳多樣性較其它種群豐富。

圖1　引物H9對(duì)16個(gè)草履蚧種群的RAPD-PCR結(jié)果Fig.1　RAPD-PCR results of primer H9 for 16 populations of D.corpulenta1—4: HL、HF、HZ、HS; 5—8: HB、HW、HC、HM; 9—12: SC、SX、SZ、SB; 13—16: BY; BB; BZ; BBT; 17: DL2000

表3　不同種群遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics on the genetic diversity of different populations

2.2遺傳多樣性分析

Nei指數(shù)估計(jì)的不同種群間遺傳距離和遺傳一致度結(jié)果見表4。由表4可知，16個(gè)種群Shannon信息指數(shù)的變化范圍在0.1708—0.2967之間，平均值為0.2306。邯鄲桑樹種群的Shannon信息指數(shù)最高，邯鄲紫薇種群最低。16個(gè)種群Nei's基因多樣性指數(shù)變化范圍在0.1101—0.1991之間，平均值為0.1511。邯鄲桑樹種群的基因多樣性最高，保定紫葉碧桃種群最低，這與Shannon信息指數(shù)估計(jì)的遺傳多樣性稍有差異。說明同一物種不同種群遺傳多樣性存在差異。

2.3遺傳相似度與遺傳距離分析

由表4可知，16個(gè)草履蚧種群的遺傳相似度在0.6466—0.9290之間，平均值為0.7873;遺傳距離在0.0701—0.4360之間，平均值為0.2395，說明不同種群間遺傳差異較大。其中以邯鄲楓楊和以邯鄲垂絲海棠為寄主的草履蚧種群最相似，遺傳距離最小(0.0701);以石家莊紫葉李和以邯鄲木槿為寄主的種群遺傳距離最大(0.4360)，說明二者的遺傳差異最大。

紫葉李邯鄲種群與石家莊種群遺傳距離為0.3330，與保定種群遺傳距離為0.3426;紫葉碧桃邯鄲種群與石家莊種群遺傳距離為0.3170，與保定種群遺傳距離為0.3816;即同種寄主不同地理種群隨地理距離的增加遺傳距離增加。

2.4種群遺傳相似度聚類分析

用NTSYSpc2.1對(duì)草履蚧種群的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA聚類分析，進(jìn)一步分析種群間遺傳關(guān)系(圖2)。結(jié)果顯示:同一地理寄主種群絕大多數(shù)個(gè)體都能聚為一類，說明同一種群中個(gè)體間的遺傳特性相似程度高，遺傳穩(wěn)定性;草履蚧相同寄主種群首先聚類，遺傳相似系數(shù)在0.67水平，說明寄主因素對(duì)草履蚧的種群分化產(chǎn)生明顯的影響;保定、石家莊、邯鄲的紫葉碧桃種群各自聚類，且遺傳距離較遠(yuǎn);同樣以上3地的紫葉李種群也各自聚類，說明地理因素對(duì)種群的分化產(chǎn)生影響;草履蚧不同寄主的三大地理種群并未產(chǎn)生明顯地理聚類，說明相對(duì)于地理因素，寄主因素對(duì)草履蚧種群分化的影響更加明顯。同一地區(qū)不同寄主種群聚類見圖3、圖4、圖5，可見同一地區(qū)同一寄主的個(gè)體聚為一類，而同一地區(qū)不同寄主間聚類規(guī)律不明顯。

3結(jié)論與討論

本文通過以上對(duì)草履蚧不同寄主和地理種群遺傳分化的RAPD分析，表明: Shannon信息指數(shù)和Nei's基因多樣性指數(shù)顯示草履蚧不同地理種群以及不同寄主種群遺傳多樣性豐富程度不同，草履蚧不同寄主種群之間存在不同程度的遺傳差異，并已產(chǎn)生種群分化。草履蚧相同寄主不同地理種群之間存在遺傳差異，地理因素對(duì)草履蚧種群分化產(chǎn)生影響。聚類分析結(jié)果顯示，草履蚧種群分化同時(shí)受到寄主因素和地理因素的雙重影響，相對(duì)于地理因素，寄主對(duì)草履蚧種群分化的影響更加明顯。

草履蚧寄主植物廣泛，主動(dòng)擴(kuò)散距離有限，因此其發(fā)生與寄主植物關(guān)系十分密切。本研究表明草履蚧不同寄主種群之間已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的種群分化，這與草履蚧寄主生態(tài)條件、環(huán)境脅迫有密切關(guān)系。寄主植物自身的物理、化學(xué)等因素可影響植食性昆蟲的生物學(xué)習(xí)性和遺傳特性，促進(jìn)昆蟲種群分化，而昆蟲對(duì)寄主植物具有選擇性，對(duì)于不同寄主植物喜好程度也不盡相同［9-10］。昆蟲學(xué)家認(rèn)為植食性昆蟲可因嗜食的寄主不同而造成遺傳隔離，由此形成不同的物種。Takada、Blackman、Weber等研究表明煙蚜在不同寄主植物上存在著種群分化［11-13］。本實(shí)驗(yàn)中寄主植物分類科屬不盡相同，其生物學(xué)特性和化學(xué)成分各異，我們推測寄主植物種類不同是造成草履蚧種群分化的重要原因。

此外，大氣污染以及昆蟲群落結(jié)構(gòu)［14-15］等環(huán)境脅迫均能影響寄主植物與昆蟲的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)寄主植物除受到草履蚧危害外，同時(shí)受到其他不同種昆蟲取食。不同寄主植物上昆蟲的種類、數(shù)量以及植物所處環(huán)境的不同可能都對(duì)草履蚧種群分化期作用，下一步有待從多因素分析探討草履蚧種群分化原因。

圖2　16個(gè)草履蚧種群聚類分析圖Fig.2 The UPGMA dendrogram cluster of 16 Drosicha corpul populations種群代號(hào)同表1(See table 1 for explanation of population code);為了方便比較查看，本圖中每個(gè)種群采用5個(gè)樣本的聚類分析;其聚類分析趨勢與全部個(gè)體聚類圖相一致，具有代表性

圖3　石家莊草履蚧種群聚類分析圖Fig.3 The UPGMA dendrogram cluster of Drosicha corpul populations of Shijiazhuang

圖4　保定草履蚧種群聚類分析圖Fig.4 The UPGMA dendrogram cluster of Drosicha corpul populations of Baoding

圖5　邯鄲草履蚧種群聚類分析圖Fig.5 The UPGMA dendrogram cluster of Drosicha corpul populations of Handan

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RAPD analysis of genetic differentiation in the different hosts and geographic populations of Drosicha corpulenta

LIU Junxia1，2，LIU Quanchao1，JIANG Wenhu1，SONG Xiaoying1，GAO Baojia1，2，*
1 College of Forestry，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，China
2 Key Laboratory of Germplasm Resources of Forest Trees and Forest Protection College of Forest of Hebei，Baoding 071000，China

Abstract:The genetic diversity and population differentiation among geographic populations of 16 different Drosicha corpulenta host collected from Baoding，Shijiazhuang，and Handan in Hebei were analyzed by RAPD.The results showed that four RAPD primers were amplified out of 41 polymorphism loci，and that the percent of polymorphic loci was 100％.The genetic distance index of the populations ranged from 0.0701 to 0.4360 and the average value was 0.2395.The genetic distance index for D.corpulenta populations on Pterocarya stenoptera and Malus halliana(Voss.)Koehne in Handan was the smallest(0.0701).The genetic distance index for D.corpulenta populations on Prunus cerasifera in Shijiazhuang and Hibiscus syriacus in Handan was the largest of all，and the similarity coefficients ranged from 0.6466 to 0.9290.The genetic diversity of the different D.corpulenta populations was classified as abundant，and genetic differences were found.According to the results of cluster analysis，the genetic diversity of D.corpulenta populations was affected by both host and geographic location，and the different host populations of D.corpulenta showed obvious genetic differentiation.

Key Words:Drosicha corpulenta; host plant; population differentiation; RAPD

*通訊作者

Corresponding author.E-mail: baojiagao@ 163.com

收稿日期:2013-06-13;網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-06-10

基金項(xiàng)目:河北省自然基金(C2009000592)

DOI:10.5846/stxb201306131697