馬學(xué) 綜述 董強(qiáng) 審校

睪丸Leydig細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)研究進(jìn)展*

馬學(xué)1綜述 董強(qiáng)2審校

(1. 四川大學(xué)華西醫(yī)院小兒泌尿外科；2. 四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿外科， 成都 610041)

Leydig細(xì)胞是位于哺乳動物睪丸間質(zhì)中的一種內(nèi)分泌細(xì)胞，在促進(jìn)胚胎期生殖器官的分化發(fā)育、男性第二性征的發(fā)育和維持、精子發(fā)生、激發(fā)性欲以及維持性功能和促進(jìn)人體的新陳代謝等方面發(fā)揮重要作用。因此，針對Leydig細(xì)胞的起源、分化發(fā)育機(jī)制的研究已經(jīng)成為當(dāng)今國際男性生殖健康研究領(lǐng)域的前沿和熱點。本文對該領(lǐng)域近年來的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

Leydig細(xì)胞;睪酮;發(fā)育生物學(xué)

Leydig細(xì)胞是哺乳動物睪丸間質(zhì)中一種內(nèi)分泌細(xì)胞，具有合成和分泌睪酮(Testosterone, T)的功能，是男性體內(nèi)雄激素的最主要來源，其功能受下丘腦-垂體性腺軸的調(diào)控[1]。其分泌的睪酮通過血液循環(huán)被運(yùn)輸?shù)饺砀魈幍陌衅鞴? 再通過與雄激素受體結(jié)合進(jìn)而在促進(jìn)胚胎期生殖器官的分化發(fā)育、男性第二性征的發(fā)育和維持、精子發(fā)生、激發(fā)性欲以及維持性功能和促進(jìn)人體的新陳代謝(如促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、骨骼生長及紅細(xì)胞生成等)等方面發(fā)揮重要的作用[1，2]。幾十年來，伴隨著工業(yè)化社會的發(fā)展，越來越多的與環(huán)境污染密切相關(guān)的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)可以通過影響胚胎Leydig細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能干擾胚胎期生殖器官的發(fā)育，從而導(dǎo)致泌尿生殖系統(tǒng)先天性畸形疾病(例如隱睪、尿道下裂、真/假兩性畸形等)的發(fā)生率逐年上升，給眾多患兒及其家庭和社會帶來了生理、心理上的巨大痛苦和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。與發(fā)達(dá)國家一樣，發(fā)展中國家的人口老齡化亦在迅速推進(jìn)，因此，以遲發(fā)性睪丸功能減退(Late onset hypogonadism in males，LOH)為代表的老齡男子的健康和生活質(zhì)量問題已引起全社會，尤其是醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注[3]。研究表明，老年男性睪丸Leydig細(xì)胞數(shù)量的減少和分泌功能的減退是導(dǎo)致老年男性部分雄激素缺乏的主要原因。因此，針對Leydig細(xì)胞的起源、分化發(fā)育機(jī)制的研究已經(jīng)成為當(dāng)今國際男性生殖健康研究領(lǐng)域的前沿和熱點。對Leydig細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)的進(jìn)一步全面了解將有助于我們更加深入地理解和認(rèn)識男性生殖器官的分化發(fā)育、男性生殖生理以及雄激素紊亂相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療此類疾病提供理論基礎(chǔ)和開辟新的途徑。本文從以下兩方面綜述該領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

1 Leydig細(xì)胞分化發(fā)育模式

圖1 Leydig細(xì)胞系發(fā)育模式圖

Figure 1 Developmental modes of Leydig cell lineage

根據(jù)目前的研究結(jié)果，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Leydig細(xì)胞系在個體發(fā)育過程中有兩種不同的類型: 胚胎型Leydig細(xì)胞(Fetal Leydig cell，F(xiàn)LC)和成年型Leydig細(xì)胞(Adult Leydig cell, ALC)。胚胎型Leydig細(xì)胞的主要功能是分泌睪酮，促進(jìn)胚胎期胎兒的性別分化和泌尿生殖器官的發(fā)育，在出生后睪丸中的FLC開始減少并逐漸消亡[4,5]。成年型Leydig細(xì)胞的主要功能是合成和分泌睪酮，其在促進(jìn)男性第二性征的發(fā)育和維持、精子發(fā)生、激發(fā)性欲、維持性功能以及促進(jìn)人體的新陳代謝等方面起著重要的作用[6]。其中，關(guān)于FLC與ALC的關(guān)系問題存在不同的觀點：一方面，部分學(xué)者認(rèn)為FLC在個體出生后逐漸消亡，與ALC是兩種完全不同的細(xì)胞類型，兩者之間沒有相互影響；另有學(xué)者認(rèn)為，F(xiàn)LC在個體出生后并沒有完全消亡，而是以某種形式沉默或通過某種方式轉(zhuǎn)分化為ALC細(xì)胞系[7-10]。

1.1 胚胎型Leydig 細(xì)胞(Fetal Leydig cell，F(xiàn)LC) 小鼠FLC 在胚胎第12.5天左右即開始在睪丸間質(zhì)中形成，大鼠大約在第14.5 天，而人類大約在第7～8周。當(dāng)FLC分化完全后，F(xiàn)LC的形狀逐漸由紡錘梭狀形向橢圓形轉(zhuǎn)變，并且獲得合成類固醇激素的能力。與成年型Leydig細(xì)胞一樣，F(xiàn)LC具有豐富的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴，唯一不同的是的其高爾基體發(fā)育不完全，細(xì)胞膜表面有非常多的突起。此外，F(xiàn)LC易成簇，周圍包裹有膠原和層粘連蛋白；出生后，成簇的FLC逐漸開始分解[11,15]。

有關(guān)FLC的起源現(xiàn)在仍有很多爭論，大體上認(rèn)為FLC可能有4種起源即：腎上腺-性腺原基(中胚層)，中胚層神經(jīng)嵴，中腎，體腔上皮。FLC分化完成后，其數(shù)目急劇增加。以大鼠為例，在胚胎第17 天時，每個睪丸FLC的平均數(shù)目是2.5×104個，而在第21 天時則激增至1×105個[12]。在FLC產(chǎn)生的一系列分子中，雄激素和胰島素樣因子3(INSL3)至關(guān)重要。Alfred Jost首先發(fā)現(xiàn)了睪丸起源的雄激素對午非氏管發(fā)育的重要性。他利用兔胚胎證實，去勢可以導(dǎo)致午非氏管退化，但這種退化可以被睪酮所抑制。FLC可以產(chǎn)生胰島素樣因子3(insulin-like factor 3, INSL3)，后者可與其受體相結(jié)合，是促使睪丸降入陰囊的關(guān)鍵因子；在哺乳動物中，精子生成所需要的溫度相對較低，因此，睪丸下降進(jìn)入陰囊對于精子的生成至關(guān)重要[16-21]。

1.2 成年型Leydig細(xì)胞(Adult Leydig cell，ALC) 目前的研究認(rèn)為，成年型Leydig細(xì)胞(Adult Leydig cell，ALC)是由Leydig干細(xì)胞(stem Leydig cell，SLC)分化而來；ALC的分化包括4個階段，即Leydig干細(xì)胞、Leydig祖細(xì)胞(Progenitor Leydig cell，PLC)、 未成熟型Leydig細(xì)胞(immature Leydig cells，ILC)以及成熟型Leydig細(xì)胞(ALC)[1]。在Leydig細(xì)胞系分化發(fā)育過程中，LH 的結(jié)合能力、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的含量以及睪酮的產(chǎn)生能力均逐漸增加。SLC 在出生時就已經(jīng)存在于睪丸的間質(zhì)中，在出生后不久開始定向分化成Leydig細(xì)胞系并且進(jìn)一步增殖，最終分化為成熟的ALC。由于缺乏特異性的細(xì)胞表面標(biāo)記，對SLC的分離鑒定方面的研究進(jìn)展緩慢。許多候選的SLC表面分子標(biāo)記物都是一些激素的受體，包括白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)，血小板衍生生長因子α(Platelet-derived growth factor receptor-α，PDGFRα)以及黃體生成素受體(LHR)。假定的Leydig干細(xì)胞應(yīng)該具有如下特征：具有自我更新能力，能夠在體外擴(kuò)增而不分化；具有分化潛能，能夠表達(dá)類固醇合成相關(guān)的酶類，例如3β-HSD等，最終可以合成睪酮；當(dāng)被移植到受體的睪丸間質(zhì)中時，可以存活并且分化成Leydig細(xì)胞系。有研究者在大鼠出生后第7 天的睪丸中分離獲得了一些具有上述特征的細(xì)胞，并認(rèn)為這些細(xì)胞就是Leydig干細(xì)胞。這些細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)擴(kuò)增6個月保持不分化，經(jīng)誘導(dǎo)后可以表達(dá)Leydig細(xì)胞的一些分化標(biāo)志，例如LHR、CYP-11B1、3β-HSD、CYP-17A1等；當(dāng)把這些細(xì)胞移植入缺失Leydig細(xì)胞的睪丸中時，其可以存活并且表達(dá)3β-HSD等[6]。

2 Leydig細(xì)胞發(fā)育過程調(diào)控

2.1 FLC發(fā)育的分子調(diào)控 FLC開始出現(xiàn)在胚胎期的睪丸中，所以認(rèn)為其分化受到性染色體組分或睪丸特殊機(jī)制的調(diào)控。Burgogne通過帶有XX和XY 的雜交鼠胚胎發(fā)現(xiàn)，XX和XY都可以形成FLC[16]。Y染色體上的性別決定基因(SRY)在Leydig細(xì)胞中不表達(dá)，這說明FLC的分化間接受到SRY基因的調(diào)控[14-16]。Dhh基因?qū)eydig細(xì)胞分化起著決定性作用， Dhh基因敲除可導(dǎo)致Leydig細(xì)胞的減少，從而導(dǎo)致雄激素分泌嚴(yán)重不足，出現(xiàn)隱睪，性器官萎縮等臨床疾??；人類的Dhh基因突變也會出現(xiàn)上述變化。Dhh以旁分泌的形式刺激Leydig前體細(xì)胞的分化，特別是刺激SF-1和P450scc表達(dá)。然而，當(dāng)Leydig細(xì)胞分化完全時，Dhh基因?qū)⒈灰种?。PDGFRα也可刺激Leydig細(xì)胞的增殖，當(dāng)其基因被敲除后也會導(dǎo)致Leydig細(xì)胞數(shù)目的下降[17-19]。Dhh和PDGFRα兩種細(xì)胞信號途徑呈平行式調(diào)控Leydig細(xì)胞的分化。胰島素生長因子1(IGF-1)可以刺激Leydig細(xì)胞增殖，引起類固醇產(chǎn)生；IGF-1基因突變可導(dǎo)致Leydig細(xì)胞數(shù)目的下降，導(dǎo)致類固醇產(chǎn)生的降低。上述發(fā)現(xiàn)說明，Leydig細(xì)胞分化的調(diào)控是一個網(wǎng)狀系統(tǒng)，但其具體作用方式尚未闡明。

除了旁分泌的因子以外，多種轉(zhuǎn)錄因子也參與了對FLC分化的調(diào)控。Pod1(Capsulin/Epicardin/ Tcf21)基因成螺旋-環(huán)螺旋狀分子，能夠促進(jìn)側(cè)鏈切割酶(Scc)陽性細(xì)胞的增加，但當(dāng)Pod1基因被敲除后，將導(dǎo)致雄激素分泌不足或缺如。有研究發(fā)現(xiàn)，Pod1可以防止FLC分化不成熟，當(dāng)FLC增加時，控制類固醇的產(chǎn)生。在Arx(X-linked aristaless-related homeobox gene)基因突變的小鼠中發(fā)現(xiàn)FLC分化障礙，在小鼠中Arx不在FLC中表達(dá)，這說明Arx間接調(diào)控FLC的分化。FLC中也有雌激素受體(Estrogen receptor，ER)的表達(dá)，當(dāng)ER失活時，F(xiàn)LC出現(xiàn)肥大，并可產(chǎn)生大量的睪酮，這表明外源性雌激素可以通過雌激素受體來調(diào)控FLC產(chǎn)生類固醇[20]。但是，這些轉(zhuǎn)錄因子之間究竟是如何相互作用以及它們與旁分泌因子之間的關(guān)系和機(jī)制仍不清楚。與成年型Leydig細(xì)胞不同的是，F(xiàn)LC的發(fā)育不直接受到促黃體生成激素(LH)的調(diào)控，因為直到其分化完成后48～72 hFLC才表達(dá)LH受體，同時也是在FLC分化完成后72 h以后才能在血清中檢測到LH，而ALC則受LH的調(diào)控；而且在LH及LH受體敲除的小鼠中FLC的分化正常。

2.2 ALC發(fā)育特征及其分子調(diào)控 在成年睪丸組織中，Leydig干細(xì)胞始終存在，可隨時分化為成熟的ALC；以大鼠為例，在出生后第11 ～ 28 天之間，Leydig干細(xì)胞開始進(jìn)入Leydig細(xì)胞系的分化狀態(tài)，形成PLC并開始表達(dá)類固醇生成酶系和LH受體。Leydig祖細(xì)胞個體較小，外觀呈紡錘梭狀形，PLC與SLC比較不同的是，PLC可表達(dá)LH受體和類固醇生成酶系(如3β-HSD)；但是PLC 表達(dá)類固醇生成酶的能力比較低。在PLC中，還可見到PDGFRα、LIFR和c-kit等的表達(dá)，這表明Leydig祖細(xì)胞還保留有一些Leydig干細(xì)胞的特征。Leydig祖細(xì)胞逐漸變大變圓，增殖活性逐漸降低，開始退出細(xì)胞周期；并逐步表達(dá)P450scc、3β-HSD和P450c17，PLC基本上不表達(dá)或極少量表達(dá)17β-HSD3。PLC可以繼續(xù)分化生成為未成熟的Leydig細(xì)胞(ILC)。ILC在大鼠出生后28～56 天開始出現(xiàn)，并大量表達(dá)3β-HSD和LH受體。ILC內(nèi)含有大量的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴，這些脂滴在分化成ALC 后逐漸消失。在ILC時段，睪酮生成酶P450scc、3β-HSD和P450c17活性大大增加，但是17β-HSD3在第56 天后才開始表達(dá)。ILC在出生后56 天分化成為ALC，后者含有豐富的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、很少的脂滴和全部的類固醇生成酶。ALC 主要功能是分泌睪酮，而ILC的主要功能則是分泌3α-Diol。ALC中5α-還原酶顯著降低。ALC是成熟睪丸中的主要細(xì)胞群體，但其前體細(xì)胞ILC 始終存在于成熟睪丸內(nèi)部[1,22]。

多種調(diào)控因子密切地調(diào)控Leydig細(xì)胞和類固醇的生成。促性腺激素(LH)是調(diào)控Leydig細(xì)胞分化最主要因子，但是在早期SLC階段，LH受體并不表達(dá)，所以還有其他因子參與調(diào)控。白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)是白介素-6(IL-6)家族成員，其受體由其特異結(jié)合亞基gp190和轉(zhuǎn)膜信號傳導(dǎo)亞基gp130組成[23]。LIF是胚胎干細(xì)胞保持其多能性的一個關(guān)鍵因子。在大鼠睪丸中，LIF在胚胎期第13.5 天就可被檢測到，它主要在圍繞生精小管周圍的管周細(xì)胞中表達(dá)。分化后的Leydig細(xì)胞中LIF的表達(dá)升高，則會導(dǎo)致類固醇生成降低，主要原因是LIF減少P450scc酶的底物產(chǎn)生。LIF可促進(jìn)胚胎Leydig細(xì)胞的增殖，與LIF相關(guān)性很大的因子IL-6在不成熟睪丸中也有表達(dá)。IL-6受體主要在PLC和ILC 中表達(dá)[24]。因此LIF和IL-6都可以調(diào)控胚胎型Leydig細(xì)胞和早期Leydig細(xì)胞。血小板衍生因子(Platelet derived growth factor, PDGFs)是一個二硫鍵連接的同源二聚體蛋白家族，其主要功能是在胚胎早期對未分化細(xì)胞促進(jìn)有絲分裂作用，其也在組織重塑中起作用[25]。PDGF受體α對FLC的分化起著決定性作用，同時也可促進(jìn)ALC的分化。在PDGFAA配體敲除的小鼠中，ALC 不能分化。在胚胎期PDGF的表達(dá)先于LHR，因此，PDGF受體α信號途徑可能是促進(jìn)胚胎型Leydig細(xì)胞向ALC分化的最早因子。Kit受體在A1型精原細(xì)胞和Leydig細(xì)胞中表達(dá)。Kit在小鼠出生后7 天就可被檢測到。與ILC和ALC相比，Kit在PLC中表達(dá)量最高。除Sertoli細(xì)胞外，SLC也產(chǎn)生Kit配體。Kit配體的主要功能是促進(jìn)生殖細(xì)胞的增殖和存活。由此推測，Kit配體對Leydig細(xì)胞也具有類似的功能。在Kit 敲除的轉(zhuǎn)基因鼠中發(fā)現(xiàn)，在成年期睪丸中Leydig細(xì)胞增生和睪酮生成下降，這預(yù)示著Kit調(diào)控Leydig細(xì)胞增殖[26,27]。

促黃體生成激素(LH)是Leydig細(xì)胞合成睪酮至關(guān)重要的調(diào)節(jié)因子。LH與LH受體結(jié)合，激活cAMP信號級聯(lián)效應(yīng)，動員膽固醇，提高類固醇酶活性。LH信號中斷，則可導(dǎo)致類固醇酶活性降低，類固醇生成細(xì)胞數(shù)目減少并萎縮[28,29]。在GnRHhpg轉(zhuǎn)基因鼠中，LH缺陷，Leydig細(xì)胞的數(shù)目明顯下降，與陽性對照組相比，只有對照組的10%。在體外大鼠ILC培養(yǎng)中，LH可以促進(jìn)ILC的DNA合成，但這種增加是有限的，但當(dāng)加入IGF-1因子時，其作用被顯著增強(qiáng)。上述結(jié)果說明，在LH促進(jìn)Leydig細(xì)胞增殖過程中需要其他的因子參與。胰島素樣生長因子1(Insulin-like growth factor 1, IGF-1)的mRNA及其蛋白和受體都存在于Leydig細(xì)胞中，在出生后第4 天的大鼠睪丸中就可以檢測到由IGF-1、LH和hCG刺激所導(dǎo)致的IGF-1分泌，并可上調(diào)IGF-1受體的表達(dá)。IGF-1可刺激Leydig細(xì)胞的增殖，并且當(dāng)與LH協(xié)同作用時，這種增殖作用可以被擴(kuò)大。IGF-1與LH共同作用可以促進(jìn)Leydig細(xì)胞的分化和成熟。在體外實驗中，IGF-1可以刺激Leydig細(xì)胞的成熟，提高類固醇酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)睪酮的產(chǎn)生[31]。在IGF-1基因敲除的小鼠中，睪酮的水平嚴(yán)重不足，睪丸變小，Leydig細(xì)胞的數(shù)目降低。卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone, FSH)可提高Sertoli細(xì)胞的功能，反過來也可間接地作用于Leydig細(xì)胞。目前對FSH 與Leydig細(xì)胞發(fā)育影響的具體機(jī)制還不清。有研究發(fā)現(xiàn)，給LH分泌不足的小鼠注射FSH可以促進(jìn)Leydig細(xì)胞的分化和提高類固醇生成活性。但在LH分泌的正常小鼠中，，F(xiàn)SH的作用也不十分顯著。FSH基因突變后，Leydig細(xì)胞的數(shù)目并沒有太大的改變[30]。

雄激素受體存在于Leydig細(xì)胞所有階段，但在PLC和ILC中雄激素受體呈高表達(dá)；雄激素受體的存在說明雄激素直接參與調(diào)控Leydig細(xì)胞的發(fā)育和功能。當(dāng)把PLC與LH和雙氫睪酮共培養(yǎng)3 天時，PLC產(chǎn)生睪酮水平提高10倍。LH 受體在PLC中含量很少，這說明雄激素可以提高PLC對LH的反應(yīng)強(qiáng)度。雄激素可以促進(jìn)PLC中LH受體、雄激素受體和3β-HSD的蛋白活性的增加；雄激素受體發(fā)生突變時可以導(dǎo)致Leydig細(xì)胞數(shù)目的降低和Leydig細(xì)胞分化不完全[32,33]。

3 小結(jié)

目前，在Leydig細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)方面仍然存在許多亟待闡明的問題，主要集中于：①胚胎型Leydig細(xì)胞和成年型Leydig細(xì)胞之間有無發(fā)育上的聯(lián)系。②Leydig細(xì)胞系從原始細(xì)胞階段向成熟細(xì)胞階段分化發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。③Leydig干細(xì)胞的起源(其定位及其與管周間葉細(xì)胞的關(guān)系等)。④FLC與ALC是否來源于同一干細(xì)胞系等。對Leydig細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)的進(jìn)一步研究將有助于更加深入地理解和認(rèn)識雄激素及其靶器官的生理病理機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療雄激素相關(guān)疾病提供新的思路。

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Advances in research of developmental biology of Leydig Cells

MA Xue1reviewingDONG Qiang2checking

(1.DepartmentofPediatricUrology,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China；2.DepartmentofUrology,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

Leydig cells are endocrine cell located in a mammalian testicular interstitial that play important roles in promoting genital differentiation of embryonic development, the development and maintenance of male secondary sex characteristics, spermatogenesis, maintain sexual function and the body′s metabolism. Therefore, the origin, mechanism of differentiation and development of Leydig cells has become the highlights of male reproductive health research. Progress in the field has been discussed in this review.

Leydig cell; Testosterone; Developmental biology

四川省科技廳支撐計劃(2014SZ0031)；四川省西部精神醫(yī)學(xué)協(xié)會科研基金(Wcpafund2014-10)

董強(qiáng)，教授，本刊常務(wù)編委，E-mail：dqiang@gmail.com.

R

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.02.043

2015-10-08； 編輯： 張文秀)