溫桂海 王濤 朱濤

二氫青蒿素抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞GLUT1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

溫桂海1王濤1朱濤2

(1.邯鄲市中心醫(yī)院普外一科， 河北 邯鄲 056001；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院， 成都 四川 610041)

目的 研究二氫青蒿素對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞的抑制作用和對(duì)GLUT1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)的信號(hào)通路。方法 使用不同濃度的二氫青蒿素(0μM、10μM和60μM)對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。在不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、24h和48h)使用MTT法對(duì)PANC-1細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定。在干預(yù)48h后，使用qPCR對(duì)二氫青蒿素干預(yù)的PANC-1細(xì)胞GLUT1 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。使用western blot對(duì)二氫青蒿素干預(yù)的PANC-1細(xì)胞GLUT1蛋白表達(dá)水平以及PI3K和Akt磷酸化水平進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果 使用不同濃度二氫青蒿素(0μM、10μM和60μM)對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞活性呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。二氫青蒿素干預(yù)48h后，胰腺癌PANC-1細(xì)胞GLUT1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平以及PI3K和Akt磷酸化水平水平呈濃度依賴性的下降，差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 本基礎(chǔ)研究提示二氫青蒿素可以通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路的活化水平下調(diào)胰腺癌PANC-1細(xì)胞GLUT1 mRNA和蛋白的表達(dá)，并對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步二氫青蒿素應(yīng)用于胰腺癌等腫瘤的臨床治療奠定了一定的基礎(chǔ)。

二氫青蒿素； 胰腺癌； PANC-1細(xì)胞； 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1； PI3K； Akt

胰腺癌(pancreatic cancer)是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，約占人類腫瘤發(fā)病率的2%左右，其中以導(dǎo)管細(xì)胞腺癌(duct cell carcinoma)最為常見(jiàn)[1-5]。由于胰腺解剖位置較深不易直接觸及和發(fā)現(xiàn)，致使大多數(shù)胰腺癌患者就診時(shí)已處于腫瘤的中晚期，多數(shù)以喪失根治性手術(shù)的時(shí)機(jī)。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示胰腺癌的5年生存率僅在15%～25%[1-5]。同時(shí)近期的臨床研究發(fā)現(xiàn)由于人口老齡化及吸煙等環(huán)境因素，致使我國(guó)胰腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1-5]。二氫青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)是抗瘧疾藥青蒿素(Artemisinin)的衍生物，其同樣具有顯著的抗瘧疾的藥理價(jià)值。近期的研究發(fā)現(xiàn)除抗瘧外二氫青蒿素還具有抑制炎癥反應(yīng)、抑制腫瘤增殖、分化、浸潤(rùn)以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬的生物活性[6-10]。同時(shí)進(jìn)一步的研究顯示二氫青蒿素的抗腫瘤活性與調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路密切相關(guān)[11-13]。本基礎(chǔ)研究的目的是探討二氫青蒿素對(duì)于胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖的影響及其相關(guān)的信號(hào)通路和分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 PCR試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；鼠抗人GLUT1抗體、鼠抗人phospho-PI3K抗體、鼠抗人PI3K抗體、鼠抗人phospho-Akt抗體、鼠抗人Akt抗體和鼠抗人β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；二氫青蒿素購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Gibco公司；小牛血清購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Hyclone公司；MTT試劑盒購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 胰腺癌PANC-1細(xì)胞常規(guī)接種在含10% FBS、100g/L 青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、95%空氣、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48 h換液、傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔接種100 μL約含5×103個(gè)細(xì)胞。貼壁后無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞16h至24h，使細(xì)胞同步化。加入不同終濃度(0μM、10μM和60μM)的二氫青蒿素，在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞，0μM二氫青蒿素干預(yù)組細(xì)胞作為對(duì)照組(Control組)。使用MTT比色試驗(yàn)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h和48 h)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性(%)=(OD干預(yù)組/OD對(duì)照組)×100 (%)[14]。

1.4 細(xì)胞GLUT1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。GLUT1正義 5′-CTTTG TGGCCTTCT TTGAAGT-3′，反義5′-CCACAC AGTTG CTCCACAT-3′；β-actin正義：5′-TGGCA TTGCCG ACAG GAT-3′，反義：5′-GCTCAGGAG GAGCAAT GATCT-3′。使用β-actin作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCT公式計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。ΔΔCt= (Ct，目標(biāo)-Ct,β-actin)干預(yù)組-(Ct，目標(biāo)-Ct,-actin)對(duì)照組[15]。

1.5 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞GLUT1蛋白表達(dá)水平以及PI3K和Akt磷酸化水平 按照試劑盒操作要求，首先提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入鼠抗人GLUT1抗體、鼠抗人phospho-PI3K抗體、鼠抗人PI3K抗體、鼠抗人phospho-Akt抗體、鼠抗人Akt抗體和鼠抗人β-actin抗體，4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1: 2000)，用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法結(jié)果分析 在不同濃度(0μM、10μM和60μM)二氫青蒿素(DHA)干預(yù)后，使用MTT法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h和48h)胰腺癌PANC-1細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定。發(fā)現(xiàn)與未干預(yù)細(xì)胞(0μM DHA)相比較，給予二氫青蒿素干預(yù)的胰腺癌PANC-1細(xì)胞活性呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 MTT比色法測(cè)定PANC-1細(xì)胞活性

注：對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)與0μM相比較 ①P<0.05;#對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)與10μM相比較 ②P<0.05

2.2 GLUT1 mRNA和蛋白的表達(dá) 在給予胰腺癌PANC-1細(xì)胞不同濃度(0μM、10μM和60μM)二氫青蒿素(DHA)干預(yù)48h后，使用qPCR和western blot法對(duì)PANC-1細(xì)胞GLUT1 mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。與未干預(yù)細(xì)胞(0μM DHA)相比較，給予DHA干預(yù)的PANC-1細(xì)胞GLUT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見(jiàn)表2和圖1。

表2 胰腺癌PANC-1細(xì)胞GLUT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平以及PI3K和Akt磷酸化水平

注：與0μM相比較 ①P<0.05;與10μM相比較 ②P<0.05

圖1 胰腺癌PANC-1細(xì)胞GLUT1蛋白表達(dá)的western blot結(jié)果

Figure 1 Western blot result of the protein expression of GLUT1 in pancreatic cancer PANC-1 cells

2.3 PI3K磷酸化水平 在給予胰腺癌PANC-1細(xì)胞不同濃度(0μM、10μM和60μM)二氫青蒿素(DHA)干預(yù)48h后，使用western blot法對(duì)細(xì)胞PI3K磷酸化水平(phospho-PI3K/total PI3K)進(jìn)行檢測(cè)。與未干預(yù)細(xì)胞(0μM DHA)相比較，給予DHA干預(yù)后的PANC-1細(xì)胞PI3K磷酸化水平呈劑量依賴性降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見(jiàn)圖2和表2。

圖2 胰腺癌PANC-1細(xì)胞PI3K磷酸化的western blot結(jié)果

Figure 2 Western blot result of the phosphorylation of PI3K in pancreatic cancer PANC-1 cells

2.4 Akt磷酸化水平 在給予胰腺癌PANC-1細(xì)胞不同濃度(0μM、10μM和60μM)二氫青蒿素(DHA)干預(yù)48h后，使用western blot法對(duì)細(xì)胞Akt磷酸化水平(phospho-Akt/total Akt)進(jìn)行檢測(cè)。與未干預(yù)細(xì)胞(0μM DHA)相比較，給予DHA干預(yù)后的PANC-1細(xì)胞Akt磷酸化水平呈劑量依賴性降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖3和表2。

圖3 胰腺癌PANC-1細(xì)胞Akt磷酸化的western blot結(jié)果

Figure 3 Western blot result of the phosphorylation of Akt in pancreatic cancer PANC-1 cells

3 討論

胰腺癌(pancreatic cancer)是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤類型之一。據(jù)2008年世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù)顯示胰腺癌的全球新發(fā)病例約為28萬(wàn)例，發(fā)病率約為3.9/10萬(wàn)人，其發(fā)病率占總惡性腫瘤新發(fā)病例的2.2%[1-5, 16]。雖然胰腺癌的發(fā)病率僅位居惡性腫瘤發(fā)病率的第13位，但與此相對(duì)應(yīng)的是每年約3.7/10萬(wàn)的病死率，其占惡性腫瘤總死亡人數(shù)的3.5%，位居第8位[1-5, 16]。我國(guó)的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示胰腺癌的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)[1-5, 16]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)1990至2000年10年間我國(guó)的胰腺癌標(biāo)準(zhǔn)化死亡率從1.46/10萬(wàn)增加至2.38/10萬(wàn)[16]。且數(shù)據(jù)顯示胰腺癌的5年生存率僅15%～25%[1-5, 16]。同時(shí)研究表明胰腺癌的發(fā)病率上升與人口老齡化以及吸煙有顯著的相關(guān)性[1-5, 16]。另一方面由于胰腺器官解剖位置位于腹腔深部不易被觸及且胰腺癌缺乏特異性癥狀致使患者就診時(shí)多以處于疾病的發(fā)展期，多數(shù)已不適合根治性手術(shù)的治療。同時(shí)胰腺癌多數(shù)病理類型對(duì)于放化療的敏感性不佳。故發(fā)現(xiàn)一種新的治療藥物和方法對(duì)于胰腺癌的臨床治療將會(huì)有重要的價(jià)值和意義。

青蒿素(Artemisinin)是中草藥黃花蒿(Artemisia annua L)的主要藥理活性物質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為一種內(nèi)過(guò)氧化基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯化合物[17]。目前青蒿素及其衍生物包括二氫青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)主要用于瘧疾的臨床治療和預(yù)防。但近期的大量研究發(fā)現(xiàn)二氫青蒿素還具有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、分化和侵襲、抑制腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬以及抑制器官纖維化等多種生物活性[18-20]。二氫青蒿素可以有效的抑制博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺組織炎癥反應(yīng)和纖維化過(guò)程[18]；通過(guò)活化caspase-3有效的促進(jìn)凋亡誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells, GSCs)的凋亡，抑制膠質(zhì)瘤的增殖[19]；可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的糖代謝過(guò)程抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和PC-9細(xì)胞的增殖[20]。我們使用MTT法對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)與未干預(yù)細(xì)胞(0μM DHA)相比較，給予二氫青蒿素干預(yù)的胰腺癌PANC-1細(xì)胞活性呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。該結(jié)果表明二氫青蒿素對(duì)于胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖過(guò)程有顯著的抑制作用。

近期的部分研究發(fā)現(xiàn)青蒿素等衍生物的抗炎癥和抗腫瘤等藥理活性與調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路密切相關(guān)[11-13, 21]。Tan SS等的研究證實(shí)青蒿琥酯(Artesunate)可以通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路有效抑制支氣管哮喘氣道平滑肌細(xì)胞的增殖[21]。鐘軒等的研究發(fā)現(xiàn)二氫青蒿素可以通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖和Cyclin D1的表達(dá)水平[13]。我們的研究發(fā)現(xiàn)在給予胰腺癌PANC-1細(xì)胞不同濃度(0μM、10μM和60μM)二氫青蒿素干預(yù)48h后，與未干預(yù)細(xì)胞(0μM DHA)相比較，給予二氫青蒿素干預(yù)后的PANC-1細(xì)胞PI3K和Akt磷酸化水平呈劑量依賴性降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。同時(shí)由于PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)于腫瘤細(xì)胞糖代謝密切相關(guān)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 (GLUT1)的表達(dá)具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)意義，且GLUT1的表達(dá)水平與腫瘤的增殖密切相關(guān)[22]。我們對(duì)GLUT1的表達(dá)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)與未干預(yù)細(xì)胞(0μM DHA)相比較，給予二氫青蒿素干預(yù)的胰腺癌PANC-1細(xì)胞GLUT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二氫青蒿素可以通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路有效抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞GLUT1的合成。

4 結(jié)論

二氫青蒿素可以通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路的活化水平下調(diào)胰腺癌PANC-1細(xì)胞GLUT1 mRNA和蛋白的表達(dá)，并對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探討將二氫青蒿素應(yīng)用于胰腺癌等腫瘤的臨床治療奠定了一定的基礎(chǔ)。

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Dihydroartemisinin suppresses expression of GLUT1 through PI3K/Akt signal pathway in pancreatic cancer PANC-1 cells

WEN Guihai1, WANG Tao1, ZHU Tao2

(1.DepartmentofTheFirstGeneralSurgery,HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China;2.TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollage,Chengdu610000,China)

Objective To study the anti-tumor role of dihydroartemisinin (DHA) in pancreatic cancer PANC-1 cells and its involving signal pathway. Methods Three different concentrations (0μM, 10μM and 60μM) of DHA were obtained in our study. At different time points (0h, 24h and 48h), MTT assay was performed to analyze the cell viabilities of PANC-1 cells. QPCR was used to detect the mRNA expression of GLUT1. The protein expression of GLUT1 and activation (phosphorylation) of PI3K and Akt were explored by western blot. Results The cell viabilities of pancreatic cancer PANC-1 cells were concentration-dependently and time-dependently suppressed by DHA. Then, after 48 hours of interventions, we found that the mRNA and protein expression of GLUT1 and the phosphorylation of PI3K and Akt were all concentration-dependently attenuated by DHA in pancreatic cancer PANC-1 cells. Conclusion Dihydroartemisinin (DHA) could inhibit the tumor proliferation and reduce the expression of GLUT1 possibly by inactivation of PI3K/Akt signal pathway in pancreatic cancer PANC-1 cells.

Dihydroartemisinin; Pancreatic cancer; PANC-1 cells; GLUT1; PI3K; Akt

中國(guó)博士后科學(xué)基金(2014M552369)

R 73-34

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.02.008

2015-09-17； 編輯： 張文秀)