陳曾鳳 羅濤

PD150606抑制凋亡誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)位減輕心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷*

陳曾鳳1羅濤2

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院， 1.老年科，2. 心內(nèi)科， 湖北 十堰 442000)

目的 探討PD150606減輕心肌胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用及機制。方法 將原代培養(yǎng)的小鼠乳鼠心肌細胞分為3組：正常對照組、缺氧/復(fù)氧組(Hypoxia/reoxygenation，H/R)和PD150606+缺氧/復(fù)氧組(PD150606+H/R)。觀察各組心肌細胞存活率、calpain活性、凋亡情況以及心肌細胞胞漿及細胞核中凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)的表達。結(jié)果 細胞進行缺氧處理后存活率明顯下降，復(fù)氧以后存活率會進一步下降；缺氧/復(fù)氧處理后心肌細胞中calpain活性明顯升高。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，缺氧/復(fù)氧組中的細胞存活率明顯下降，細胞凋亡率明顯升高，同時我們注意到細胞漿中的凋亡誘導(dǎo)因子表達水平明顯下降，而細胞核中的凋亡誘導(dǎo)因子的表達水平明顯升高。然而PD150606能明顯抑制缺氧/復(fù)氧引起的細胞存活率下降，凋亡率增加，以及凋亡誘導(dǎo)因子向細胞核的轉(zhuǎn)位。 結(jié)論 PD150606可以減輕心肌細胞的缺氧/復(fù)氧損傷，其發(fā)揮保護作用的機制可能與其抑制凋亡誘導(dǎo)因子的轉(zhuǎn)位有關(guān)。

PD150606； 缺氧/復(fù)氧-損傷； 凋亡誘導(dǎo)因子

再灌注治療是目前急性心肌梗死最有效的治療手段，但再灌注過程中突然的血流恢復(fù)會導(dǎo)致致死性的細胞損傷，即缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，I-R)損傷。持續(xù)的心肌缺血引起顯著的細胞壞死，再灌注時由于能量代謝恢復(fù)反而加強細胞凋亡[1]。細胞凋亡被認為是心肌梗死患者再灌注后心功能仍持續(xù)下降甚至發(fā)展為心衰的重要原因[2, 3]。闡明凋亡發(fā)生的分子機制對防治I-R損傷具有重要意義。Calpain是一類鈣依賴的細胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶，它參與調(diào)節(jié)機體多種生理過程，如細胞骨架重構(gòu)、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞凋亡等[4]。通過之前的一項研究，我們發(fā)現(xiàn)calpain抑制劑PD150606可減輕I-R心肌線粒體途徑的細胞凋亡[5]，然而確切的凋亡調(diào)節(jié)機制仍然不是很清楚，有待進一步深入研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠(出生1～3天內(nèi))，雌雄不限，由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。實驗方案由第三軍醫(yī)學(xué)大學(xué)實驗動物倫理委員會批準。

1.2 原代培養(yǎng)小鼠乳鼠心肌細胞 根據(jù)我們之前實驗中的方法[6～8]，將新生乳鼠消毒，取出心臟，清洗殘留的血液后剪碎，用0.125%胰酶反復(fù)消化至組織塊消失。過濾后離心5 min，棄上清，向沉淀加入含血清的培養(yǎng)基，差速貼壁純化，計數(shù)后接種到細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。實驗采用原代培養(yǎng)48小時的心肌細胞。

1.3 缺氧/復(fù)氧模型建立 根據(jù)我們之前的方法[6～8]，用無菌PBS洗滌細胞2次，盡可能地去除培養(yǎng)基；加入缺血培養(yǎng)基后將細胞置缺氧小室，持續(xù)通入95% N2和5% CO2混合氣至氧含量低于1%，封閉缺氧小室置37 ℃培養(yǎng)箱，此過程模擬心肌缺血損傷；缺氧結(jié)束后，更換正常生長培養(yǎng)基，置CO2培養(yǎng)箱(5% CO2，95% 空氣，37 ℃)培養(yǎng)，此過程模擬心肌再灌注損傷。

1.4 CCK-8法測定細胞存活率 根據(jù)我們之前實驗方法[9]，將心肌細胞接種于96孔板內(nèi)，每孔加入CCK-8溶液10 μl，37℃避光孵育4小時，通過多功能酶標儀 Infinite M200(TECAN，瑞士)檢測光吸收值。通過與正常對照組吸光值相比計算細胞存活率。

1.5 原位檢測細胞凋亡 參照我們之前的實驗方法[6]，用末端脫氧核苷?；D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)性dUTP切口末端標記(TUNEL)和Hoechst33342共染色的方法檢測壞死周邊區(qū)域心肌細胞凋亡發(fā)生情況。簡單來說，先將細胞用4%多聚甲醛固定，再用0.1% TritonX-100 檸檬酸鈉通透。然后分別做TUNEL和Hoechst33342染色。最后計算各組TUNEL陽性心肌細胞占總細胞的比例。

1.6 Calpain活性檢測 采用我們之前研究中應(yīng)用的方法[10, 11]，通過檢測calpain的熒光底物AMC熒光變化反映calpain的活性。

1.7 Western blot檢測AIF蛋白表達 按Beyotime公司的細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒說明書操作分離細胞胞漿與細胞核蛋白。各組取等量蛋白通過SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移蛋白至NC膜上，室溫下封閉1小時，然后與兔來源抗AIF多克隆抗體4℃孵育過夜, 用熒光標記鼠抗兔二抗孵育，用Odyssey紅外激光掃描成像系統(tǒng)成像，通過條帶的灰度值進行定量分析。

2 結(jié)果

圖1 缺氧/復(fù)氧對小鼠乳鼠心肌細胞存活率(A)及calpain活性(B)的影響

Figure 1 Cell viability and calpain activity of cardiomyocytes under hypoxia/reoxygenation

注：n=6，與CON比較，①P<0.05；與H6組比較，②P<0.05；CON：對照組；H6：缺氧6小時；H6/R3：缺氧6小時/復(fù)氧3小時

2.1 缺氧/復(fù)氧對心肌細胞存活率及calpain活性的影響 細胞在缺氧6小時以后存活率明顯降低(與對照組相比，P<0.05)；復(fù)氧12小時后細胞存活率進一步下降(與對照組及缺氧6小時組相比，P<0.05)，見圖1A。細胞在缺氧6小時calpain活性無明顯變化，但缺氧6小時再復(fù)氧3、6及12 h，calpain活性逐漸增加(與對照組及缺氧6小時組對比，P<0.05)，見圖1B。

2.2 PD150606預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧后心肌細胞存活率的影響 與對照組相比，缺氧/復(fù)氧處理組的心肌細胞活力明顯下降(P<0.05)，而PD150606預(yù)處理能顯著改善缺氧/復(fù)氧引起的細胞活力下降(P<0.05)，見圖2。

2.3 PD150606預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧后心肌細胞凋亡率的影響 與對照組相比，缺氧/復(fù)氧處理組細胞凋亡率明顯增高(P<0.05)；而PD150606預(yù)處理能明顯抑制缺氧/復(fù)氧引起的細胞凋亡(P<0.05)，見圖3。

圖2 PD150606對細胞存活率的影響

Figure 2 PD150606 improved the cell viability under hypoxia/reoxygenation

注：n=6，與對照組比較，①P<0.05；與H/R組比較，②P<0.05

圖3 PD150606對細胞凋亡的影響

Fig 3 PD150606 reduced apoptosis caused by hypoxia/reoxygenation

注：n=6, 與對照組比較，①P<0.05；與H/R組比較，②P<0.05

圖4 細胞漿及細胞核中AIF蛋白表達變化

Fig 4 Protein expression of AIF in cytoplasm and nucleus

注：n=6, 與對照組比較，①P<0.05；與H/R組比較，②P<0.05

2.4 PD150606預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧后心肌細胞胞漿及細胞核AIF蛋白表達的影響 與對照組相比，缺氧/復(fù)氧組心肌細胞胞漿中凋亡誘導(dǎo)因子的蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；細胞核中凋亡誘導(dǎo)因子的蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，PD150606預(yù)處理則可抑制上述改變(P<0.05)，見圖4。

3 討論

心肌缺血/再灌注損傷顯著降低心肌梗死患者再灌注治療的臨床獲益。然而心肌缺血/再灌注損傷發(fā)生的確切機制仍不是很清楚，臨床上也缺乏療效確切的治療方法[12, 13]。因此，深入研究心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生機制，探索減輕心肌缺血/再灌注損傷的新方法仍然是目前研究的熱點問題。

近年來，大量研究表明，calpain在心肌/缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要的作用[5, 14, 15]。calpain屬于鈣依賴的巰基蛋白水解酶家族，生理情況下calpain活性受其內(nèi)源性抑制劑calpastatin嚴格控制，在Ca2+超載、ROS過度生成等病理因素作用下calpain被過度或不恰當?shù)丶せ钜鸾M織損傷[4]。死亡受體信號途徑(外源性凋亡途徑)和線粒體凋亡途徑(內(nèi)源性凋亡途徑)是主要的細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，缺血/再灌注過程會引起線粒體途徑的凋亡介導(dǎo)心肌損傷[16]。Joza N 等[17]發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡途徑除與Apaf1/caspase-9有關(guān)外，還可以由線粒體膜釋放凋亡誘導(dǎo)因子介導(dǎo)完成。凋亡誘導(dǎo)因子是一種凋亡誘導(dǎo)蛋白，與細胞色素C一樣位于線粒體膜，可在死亡信號的誘導(dǎo)下釋放。有研究表明，缺血/再灌注損傷與AIF的轉(zhuǎn)位密切相關(guān)[18,19]。因此我們推測calpain在缺血/再灌注損傷時介導(dǎo)細胞凋亡的作用可能與誘導(dǎo)AIF的轉(zhuǎn)位有關(guān)，而calpain的抑制劑PD150606可能是通過抑制calpain激活來抑制AIF轉(zhuǎn)位，從而減輕心肌細胞的凋亡。

在本研究中，我們通過缺氧/復(fù)氧處理造成原代培養(yǎng)的心肌細胞損傷，觀察calpain的抑制劑PD150606的保護作用。我們通過TUNEL染色來檢測不同處理組中凋亡細胞的比例，發(fā)現(xiàn)與對照組相比較，缺氧/復(fù)氧處理組中細胞凋亡率明顯增高，而PD150606預(yù)處理能明顯抑制缺氧/復(fù)氧引起的細胞凋亡，表明PD150606能夠通過抑制心肌細胞凋亡減輕缺氧/復(fù)氧造成的心肌細胞損傷。同時為了進一步明確PD150606的保護作用是否與抑制AIF從細胞漿向細胞核的轉(zhuǎn)位有關(guān)，我們通過Western blot分別對不同處理組中細胞的胞漿及細胞核中的凋亡誘導(dǎo)因子的表達進行了檢測。發(fā)現(xiàn)與對照組相比，缺氧/復(fù)氧處理后心肌細胞胞漿中凋亡誘導(dǎo)因子的表達水平明顯降低，而細胞核中凋亡誘導(dǎo)因子的表達水平明顯升高。說明凋亡誘導(dǎo)因子核轉(zhuǎn)位在缺氧/復(fù)氧引起的心肌細胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。那么缺氧/復(fù)氧過程中calpain活化是否與凋亡誘導(dǎo)因子核轉(zhuǎn)位存在聯(lián)系呢？我們做了進一步的研究。與缺氧/復(fù)氧組相比，PD150606預(yù)處理組心肌細胞胞漿中凋亡誘導(dǎo)因子的表達水平明顯升高，而細胞核中凋亡誘導(dǎo)因子的表達水平明顯降低，表明PD150606預(yù)處理能抑制缺氧/復(fù)氧引起的AIF從細胞漿向細胞核的轉(zhuǎn)位。

4 結(jié)論

PD150606減輕心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用機制，與其抑制AIF從細胞漿向細胞核的轉(zhuǎn)位，從而減少心肌細胞凋亡有關(guān)。

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PD150606 protects against Hypoxia/reoxygenation-injury by preventing apoptosis-inducing factor’s translocation

CHEN Zengfeng1, LUO Tao2

(1.DepartmentofChronicDiseaseRehabilitation,TaiheHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,Hubei,China;2.DepartmentofCardiology,TaiheHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,Hubei,China)

Objective To investigate the protective role and mechanism of PD150606 on hypoxia/reoxygenation(H/R)-injury. Methods The primary cultured mouse cardiomyocytes were divided into control group, H/R group (the cardiomyocytes were underwent H/R-treatment) and PD150606+H/R group (the cardiomyocytes were pretreated with PD150606 before H/R-treatment). The survival of cardiomyocytes was counted. Apoptotic cells were detected by TUNEL assays. The translocation of apoptosis-inducing factor from cytoplasm into the nucleus were also determined in these groups respectively at the same time. Results Compared with control, the survival of cardiomyocytes was significantly decreased, and the apoptosis rate was significantly increased The protein level of apoptosis-inducing factor in cytoplasm was significantly decreased, while the apoptosis-inducing factor in nucleus was significantly increased(P<0.05). However, these effects of H/R on cardiomyocytes were abolished by PD150606(P<0.05). Conclusion PD150606 could alleviate hypoxia/reoxygenation(H/R)-injury by preventing apoptosis-inducing factor’s translocation.

PD150606； Hypoxia/reoxygenation-injury； Apoptosis-inducing factor

十堰市科學(xué)技術(shù)研究與開發(fā)項目(15Y17)

羅濤，Email: luotao1688@163.com

R-33

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.03.012

2015-12-01； 編輯： 母存培)