張彥 張耀雷 楊永健 王強(qiáng) 馬雙陶

糖尿病雷帕霉素抵抗的分子機(jī)制研究*

張彥1張耀雷2楊永健1王強(qiáng)1馬雙陶1

(成都軍區(qū)總醫(yī)院 1.心血管內(nèi)科,2.中心實(shí)驗(yàn)室， 四川 成都 610083)

目的 以APOE基因缺陷小鼠為基礎(chǔ)建立糖尿病模型，觀察其動(dòng)脈硬化和蛋白表達(dá)的特點(diǎn)，從而揭示對(duì)雷帕霉素抵抗的分子機(jī)制。方法 將雄性APOE-/-小鼠16只隨機(jī)分為對(duì)照組和糖尿病組，糖尿病組給予腹腔注射STZ制備糖尿病模型，檢測(cè)小鼠體重、血糖、血脂，8周后取材行主動(dòng)脈根部切片，HE染色對(duì)比兩組主動(dòng)脈根部斑塊面積，行免疫組化對(duì)比粥樣斑塊中mTOR表達(dá)情況，用western-blot方法測(cè)定主動(dòng)脈mTOR表達(dá)情況。結(jié)果 糖尿病組體重較對(duì)照組有顯著下降(P<0.01)，血糖血脂顯著升高(P<0.01)，主動(dòng)脈根部斑塊面積增大(P<0.01)，斑塊內(nèi)mTOR表達(dá)下降(P<0.05)，主動(dòng)脈內(nèi)mTOR表達(dá)下降(P<0.01)。結(jié)論 糖尿病導(dǎo)致粥樣斑塊增加，斑塊內(nèi)及主動(dòng)脈內(nèi)mTOR表達(dá)下降，這可能是糖尿病雷帕霉素抵抗的分子機(jī)制之一。

糖尿?。?人雷帕霉素靶蛋白； 再狹窄

在全球范圍內(nèi)，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病都是主要的致死因素[1]，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療PCI已成為嚴(yán)重血管病變的常規(guī)治療[2]。然而即便是在藥物支架時(shí)代，支架植入術(shù)后血管再狹窄率仍然高達(dá)12%[3]。糖尿病作為再狹窄的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素越來(lái)越受到人們關(guān)注[4]。有研究表明，在使用雷帕霉素藥物洗脫支架的患者中，糖尿病較非糖尿病的再狹窄率顯著升高[5]，我們把這一現(xiàn)象定義為“糖尿病雷帕霉素抵抗”。而糖尿病人對(duì)雷帕霉素的相對(duì)不敏感的機(jī)制尚不清楚。

雷帕霉素在體內(nèi)與他克莫司結(jié)合蛋白-12(FK506- binding protein12，F(xiàn)KBP- 12)形成一個(gè)復(fù)合物抑制mTOR(哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白，mammalian target of rapamycin)的活性[6]，mTOR活性受到抑制后，進(jìn)一步抑制下游真核翻譯起始因子結(jié)合蛋白(eukaryotic initiation factor 4E- binding protein 1，4EBP1)、核糖體蛋白S6激酶1 (p70 ribosomal protein S6 kinase1， S6K1)等靶蛋白，最終起到抑制平滑肌細(xì)胞增殖，預(yù)防血管再狹窄的發(fā)生[7,8]。我們推測(cè)，可能是糖尿病環(huán)境導(dǎo)致mTOR通路發(fā)生了某種變化，最終導(dǎo)致對(duì)雷帕霉素的不敏感，從而有更多的再狹窄發(fā)生。為了驗(yàn)證我們的假設(shè)，我們進(jìn)行了該項(xiàng)研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 以C57為背景的APOE基因缺陷小鼠(北京醫(yī)科利昊生物科技有限公司)，抗體mTOR、p-mTOR(Santa Cruz Biotechnology)，抗體GAPDH(武漢博士德)，BCA蛋白定量測(cè)試試劑盒(南京凱基)，SABC三步法試劑盒(武漢博士德)，鏈脲佐菌素 STZ(sigma), PVDF膜(Millipore)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物建模及取材APOE基因缺陷小鼠16只隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組給予STZ腹腔注射制備糖尿病模型[9]，具體方法為連續(xù)腹腔小劑量注射(55mg/kg，連續(xù)注射5天)[10]。對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組給予高脂飼料喂養(yǎng)。2個(gè)月后測(cè)定空腹血糖、血脂，取材進(jìn)行主動(dòng)脈根部石蠟切片，做HE染色、免疫組化，取主動(dòng)脈行western-blot檢測(cè)。取材前空腹12小時(shí)，摘眼球取血法取血，心臟連同主動(dòng)脈一起取下，在主動(dòng)脈根部離斷主動(dòng)脈與心臟，主動(dòng)脈用于提取蛋白。

1.2.2 病理切片及免疫組化 心臟用10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，行主動(dòng)脈根部切片，然后行常規(guī)HE染色，使用Image Pro plus 多媒體彩色病理圖像分析軟件對(duì)主動(dòng)脈根部粥樣斑塊面積進(jìn)行測(cè)量[11]。免疫組化方法：石蠟切片脫蠟至水后，采用酸修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，5%BSA封閉，一抗?jié)舛?∶50，4℃過(guò)夜，二抗37℃孵育30分鐘，DAB顯色。使用Image Pro plus 多媒體彩色病理圖像分析軟件計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域面積、平均光密度值[12]。

1.2.3 Western-blot檢測(cè)主動(dòng)脈平滑肌mTOR的表達(dá) 按分子克隆實(shí)驗(yàn)指南的方法進(jìn)行裂解、抽提組織總蛋白，采用BCA 法定量蛋白濃度。4%濃縮膠，6%分離膠，80V電泳30分鐘，繼以120V電泳3小時(shí)。配制含15%甲醇的轉(zhuǎn)膜緩沖液，恒流濕轉(zhuǎn)300mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間6～7小時(shí)，每2小時(shí)更換轉(zhuǎn)膜緩沖液。PVDF膜封閉后，一抗?jié)舛?∶1000，4℃過(guò)夜，二抗?jié)舛?∶1000,37℃孵育1小時(shí)。采用GAPDH為內(nèi)參[13]。

2 結(jié)果

2.1 體重、血糖、血脂 對(duì)照組小鼠體重從實(shí)驗(yàn)開始到結(jié)束呈逐漸增加趨勢(shì)；而糖尿病小鼠則逐漸下降，至第8周時(shí)糖尿病小鼠體重顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，見表1。對(duì)照組小鼠空腹血糖從實(shí)驗(yàn)開始到第8周無(wú)明顯變化；而糖尿病組自STZ注射后1周即出現(xiàn)明顯的升高，在第3周時(shí)已>20mmol/L，且高血糖一直持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，見表2。糖尿病組的血脂水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，見表3。

表1 體重

注：①與對(duì)照組比較，P<0.01

表2 空腹血糖

注：與對(duì)照組比較，①P<0.01

表3 第8周血脂

注：與對(duì)照組比較,①P<0.01

2.2 主動(dòng)脈根部粥樣斑塊 兩組小鼠主動(dòng)脈根HE染色均可見明顯的粥樣斑塊。使用IPP軟件測(cè)量?jī)山M的斑塊面積，糖尿病組粥樣斑塊面積顯著大于對(duì)照組(P<0.01)，見圖1。

圖1 糖尿病促進(jìn)粥樣斑塊的生長(zhǎng)

Fig 1 Diabetes enhances atherosclerotic lesions

注：A.主動(dòng)脈根部粥樣斑塊HE染色，放大倍數(shù)10倍；B.主動(dòng)脈根部粥樣斑塊面積。對(duì)照組n=8，糖尿病組n=6，與對(duì)照組比較，①P<0.01

2.3 粥樣斑塊中mTOR的含量分析 對(duì)主動(dòng)脈根部切片行mTOR免疫組化分析，測(cè)量陽(yáng)性區(qū)域面積，糖尿病組較對(duì)照組有明顯減少(P<0.05)，見圖2。

2.4 western-blot結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)使用WB方法測(cè)定兩組小鼠主動(dòng)脈中mTOR的表達(dá)，結(jié)果顯示糖尿病小鼠主動(dòng)脈中mTOR含量下降(P<0.01)，見圖3。

圖2 糖尿病下調(diào)了mTOR的表達(dá)

Fig 2 Diabetes blunts the mTOR signaling pathway

注： A.mTOR免疫組化，分別放大100倍和400倍；b.陽(yáng)性區(qū)域面積百分比。與對(duì)照組比較，①P<0.05

圖3 糖尿病導(dǎo)致mTOR表達(dá)的下調(diào)

Fig 3 Diabetes blunts the mTOR signaling pathway

注：A.使用WB法測(cè)定主動(dòng)脈中mTOR的表達(dá)，內(nèi)參選用GAPDH；B.蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。與對(duì)照組比較，①P<0.01

3 討論

我們之前的臨床研究顯示，糖尿病是藥物洗脫支架植入術(shù)后冠狀動(dòng)脈再狹窄的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[14]。也有證據(jù)表明，藥物洗脫支架在預(yù)防糖尿病狀態(tài)下再狹窄的效果與使用不同類型的支架有關(guān)(everolimus洗脫支架和西羅莫司洗脫支架>紫杉醇洗脫支架和zotarolimus洗脫支架)[15]。根據(jù)這些結(jié)果可以推測(cè)，藥物支架的作用靶點(diǎn)在糖尿病患者體內(nèi)有明顯的表達(dá)差異或者活性差異。因此，本研究假設(shè)糖尿病患者對(duì)雷帕霉素的抵抗是由于雷帕霉素靶蛋白mTOR的表達(dá)異常所致。本研究的結(jié)果支持這一假設(shè),糖尿病不僅顯著增強(qiáng)了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的增長(zhǎng)，而且mTOR的表達(dá)也下調(diào)。因此，mTOR信號(hào)通路的改變可能參與了臨床上觀察到的雷帕霉素抵抗。

雖然巨噬細(xì)胞衍生的泡沫細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中占有很重要的地位, 但血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移也是動(dòng)脈粥樣硬化病變形成的關(guān)鍵事件[16]。血管平滑肌細(xì)胞的增殖不僅參與粥樣斑塊的形成,也促進(jìn)了支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生。包括血小板衍生生長(zhǎng)因子、基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子1在內(nèi)的生長(zhǎng)因子，刺激血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期并增殖[17]。目前涂層有雷帕霉素、雷帕霉素衍生物或紫杉醇的藥物支架被廣泛使用，通過(guò)抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖來(lái)預(yù)防再狹窄的發(fā)生[18]。雷帕霉素的作用靶點(diǎn)是mTOR，而mTOR信號(hào)通路可調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)。不久前的一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)表明,給予高濃度的瘦素可以激活體外培養(yǎng)的VSMCs的mTOR信號(hào)通路，這正好模擬了糖尿病和代謝綜合癥中的高瘦素血癥[19]，這也說(shuō)明高劑量的雷帕霉素可能會(huì)更有效地預(yù)防高瘦素血癥出現(xiàn)支架內(nèi)的再狹窄。但是新近的體內(nèi)研究表明,在高糖血病的環(huán)境下，mTOR信號(hào)通路表達(dá)下調(diào)[20]。這一結(jié)果表明，高劑量的雷帕霉素可能并不是一個(gè)有效地預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的治療策略。

基于當(dāng)前可用的證據(jù)，在糖尿病條件下介導(dǎo)再狹窄發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制尚未闡明。目前認(rèn)為糖尿病可以抑制mTOR信號(hào)通路，那其他的信號(hào)通路可能會(huì)出現(xiàn)代償性的上調(diào)或激活。血管平滑肌細(xì)胞在高血糖條件下增殖的機(jī)制尚需在未來(lái)的研究中去揭示。糖尿病條件下支架內(nèi)再狹窄的問(wèn)題或許可以通過(guò)使用兩種或多種藥物洗脫支架來(lái)解決?？傊?糖尿病條件下mTOR表達(dá)的減少可能是潛在的雷帕霉素耐藥的分子機(jī)制之一。

4 結(jié)論

糖尿病導(dǎo)致粥樣斑塊增加，斑塊內(nèi)及主動(dòng)脈內(nèi)mTOR表達(dá)下降，這可能是糖尿病雷帕霉素抵抗的分子機(jī)制之一。

[1]Ohira T and Iso H. Cardiovascular disease epidemiology in Asia: an overview[J]. Circ J,2013,77: 1646-1652.

[2]Fernando Alfonso. Current Treatment of In-Stent Restenosis[J]. Journal of the American College of Cardiology, 2014, 63(24):2659-2673.

[3]Cassese S, Byrne RA, Tada T,etal. Incidence and predictors ofrestenosis after coronary stenting in 10,004 patients with surveillanceangiography[J]. Heart, 2014,100:153-159.

[4]Pate GE, Lee M, Humphries K,etal: Characterizing the spectrum of in-stent restenosis: implications for contemporary treatment[J]. Can J Cardiol, 2006,22:1223-1229.

[5]Frobert Ole, Layerqvist Bo, Carlsson Jorg,etal. Differences in restenosis rate with different drug-eluting stents in patients with and without diabetes mellitus: a report from the SCAAR(Swedish Angiography and Angioplasty Registry)[J]. J Am CollCardiol, 2009, 53(18) :1660-1667.

[6]熊偉, 程金湘, 章翔. 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白研究進(jìn)展[J]. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2011, 10 (1) : 85-88.

[7]Wang L, Rhodes CJ, Lawrence JJ, Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) by insulin is associated with stimulation of 4EBP1 binding to dimericmTOR complex 1[J]. J BiolChem, 2006, 281(34): 24293-24303.

[8]Fingar DC. Mammalian cell size is controlled by mTOR and its downstream targets S6K1 and 4EBP1/eIF4E[J]. Genes Dev, 2002, 16(12): 1472-1487.

[9]張彥，馬雙陶，楊永健。糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型的建立[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2014，22(2)：186-189.

[10] Calkin AC，F(xiàn)orbes JM，Smith CM，etal．Rosiglitazone attenuates atherosclerosis in a model of insulin insufficiencyindependent of its metabolic effects [J]．ArteriosclerThrombVascBiol，2005，25 (9):1903- 1909．

[11] Xi Zheng ,Qiang Wang ,Yan Zhang,etal. Intermittent cold stress enhances features of atheroscleroticplaque instability in apolipoprotein E-deficient mice[J]. Molecular Medicine Reports, 2014, 10: 1679-1684,.

[12] Shujie Wei, Yan Zhang.Apolipoprotein E-deficient rats develop atherosclerotic plaques inpartially ligated carotid arteries[J]. Atherosclerosis, 2015, 12:589-592.

[13] Shuangtao Ma, Yan Zhang. Ablation of uncoupling protein 2 exacerbates salt-induced cardiovascular and renal remodeling associated with enhanced oxidative stress[J].International Journal of Cardiology,July (175):206-210.

[14] Ma S, Yang D, Zhang X,etal. Comparison of restenosis rate with sirolimus-eluting stent in STEMI patients with and without diabetes at 6-month angiographic follow-up[J]. ActaCardiol,2011, 66: 603-606.

[15] Bangalore S, Kumar S, Fusaro M,etal. Outcomes with various drug eluting or bare metal stents in patients with diabetes mellitus: mixed treatment comparison analysis of 22,844 patient years of follow-up from randomised trials[J]. BMJ, 2012,345: e5170.

[16] Koga J, Aikawa M. Crosstalk between macrophages and smooth muscle cells in atherosclerotic vascular diseases[J]. Vascul Pharmacol, 2012,57: 24-28.

[17] Jung F, Haendeler J, Goebel C,etal.Growth factor-induced phosphoinositide 3-OH kinase/Akt phosphorylation in smooth muscle cells: induction of cell proliferation and inhibition of cell death[J]. Cardiovasc Res,2000,48:148-157.

[18] Marx SO, Totary-Jain H, Marks AR. Vascular smooth muscle cell proliferation in restenosis[J].CircCardiovascInterv,2011, 4:104-111.

[19] Shan J, Nguyen TB, Totary-Jain H,etal. Leptin-enhanced neointimal hyperplasia is reduced by mTOR and PI3K inhibitors[J]. ProcNatlAcadSci USA, 2008,105: 19006-19011.

[20] Pasini E. Intracellular molecular effects of insulin resistance in patients with metabolic syndrome[J]. CardiovascDiabetol, 2010, 9: 46.

The molecular mechanism of diabetic rapamycin resistance

ZHANG Yan1， ZHANG Yaolei2，YANG Yongjian1，etal

(1．DepartmentofCardiology,ChengduMilitaryGeneralHospital,Chengdu610083,China；2.DepartmentofCentralLab,ChengduMilitaryGeneralHospital)

Objective On the basis of the APOE gene defect mouse diabetes model, the hardening of the arteries and the characteristics of protein expression was observed to reveal the molecular mechanisms of rapamycin resistance. Methods 16 male APOE - / - mice were randomly divided into control group and diabetes group. The diabetes group was given intraperitoneal injection of STZ. The body weight, blood glucose, blood lipid, aortic root out line section and plaque area were observed. The mTOR expression of aortic root lines and atheromatous plaque were detected. Results The weight of diabetes group decreased more significantly than that of the control group (P<0.01). The blood sugar, blood fat and plaque area of diabetes group increased more significantly than that of the control group (P<0.01). The mTOR expression of the aortic root of diabetes group increased compared with that of the control group (P<0.01). The mTOR expression of plaque of diabetes group decreased compared with that of the control group (P<0.01). Conclusion Diabetes increases atheromatous plaque, the plaque inside and intraaortic mTOR expression. This may be one of the molecular mechanisms of rapamycin resistance to diabetes.

Diabetes; mTOR; Restenosis

國(guó)家自然科學(xué)基金( 81170081、81500224)，全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項(xiàng)目(13QNP058)，四川省科技廳科技創(chuàng)新苗子工程培育項(xiàng)目(2015016)

楊永健，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，本刊常務(wù)編委，E-mail：yangyongjian38@sina.com

R-33； R 587.1

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.03.011

2015-12-01;

母存培)