王強(qiáng) 楊永健 李德 彭柯 速曉華 唐良虎 楊大春 唐兵

富氫生理鹽水對(duì)心肌梗死后心肌重構(gòu)的影響*

王強(qiáng) 楊永健 李德 彭柯 速曉華 唐良虎 楊大春 唐兵

(成都軍區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科， 四川 成都 610083)

目的 觀察富氫生理鹽水對(duì)心肌梗死心肌重構(gòu)的影響，并探討其可能機(jī)制。 方法 選用20 ～ 25 g的健康C57/BL6小鼠60只，隨機(jī)分為對(duì)照組、心肌梗死(MI)組和MI+富氫生理鹽水(HRS)組，21天后通過心臟超聲、多導(dǎo)生理記錄儀檢測(cè)心臟功能和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，病理染色觀察心肌梗死范圍、心肌肥厚和間質(zhì)纖維化，并檢測(cè)梗死交界區(qū)心肌中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)情況。 結(jié)果 腹腔注射HRS可以明顯改善小鼠心肌梗死后心臟功能(P<0.01或P<0.05)，縮小心肌梗死面積(P<0.01)，抑制非梗死區(qū)的心肌細(xì)胞肥大和間質(zhì)纖維化，增強(qiáng)心肌中超氧化物岐化酶活性，降低丙二醛、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1含量(P<0.01或P<0.05)。結(jié)論 HRS通過抑制心肌重構(gòu)來改善小鼠心肌梗死后的心臟功能，可能與其減輕氧化應(yīng)激、抑制過度炎癥反應(yīng)有關(guān)。

心肌梗死； 心肌重構(gòu)； 氫氣； 氧化應(yīng)激； 炎癥反應(yīng)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的心肌梗死(myocardial infarction, MI)是當(dāng)今嚴(yán)重危害人類健康的疾病，盡管通過早期冠脈介入治療、溶栓治療等再灌注措施，有效地降低了MI的再梗死率及死亡率，但不能逆轉(zhuǎn)心肌梗死后的心肌重構(gòu)(cardiac remodeling)；加之有相當(dāng)數(shù)量的患者由于種種原因心肌組織不能得到及時(shí)、有效的再灌注，心肌難免最終壞死，形成梗死區(qū)，從而啟動(dòng)心梗后心肌重構(gòu)[1]。過去幾十年來心力衰竭、心肌重構(gòu)的防治研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，但基于抑制神經(jīng)體液系統(tǒng)和輔助代謝優(yōu)化療法的策略尚不能完全逆轉(zhuǎn)或抑制心肌重構(gòu)[2]。2007年，日本學(xué)者Ohsawa I等發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物呼吸2%的氫氣可顯著改善腦缺血再灌注損傷，該研究迅速引起廣泛關(guān)注，并引起研究氫氣治療疾病的熱潮[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，將氫氣通過特殊處理可以制成含有濃度0.2～1.0 mmol/L氫氣的富氫生理鹽水(hydrogen-rich saline，HRS)，HRS可以明顯減輕急性的心肌缺血再灌注損傷[4, 5]。然而HRS對(duì)心肌梗死后心肌重構(gòu)這一慢性病程的影響尚不清楚。本研究采用小鼠心肌梗死模型，觀察HRS對(duì)心肌梗死心肌重構(gòu)的影響，并初步探討其可能機(jī)制，旨在為心肌梗死后心肌重構(gòu)、心力衰竭的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料 健康雄性C57/BL6小鼠60只，10～12周齡，體重20 ～ 25 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，所有實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)活性試劑盒購自南京建成生物工程研究所。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)的ELISA檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)eBioscience公司。

1.2 HRS的制備 按照筆者前期參與研究中的方法制備HRS[6]，將袋裝250 ml醫(yī)用生理鹽水抽出50 ml，加入50ml純凈的氫氣并充分混合，將含氫的生理鹽水置于0.4 MPa壓力下穩(wěn)壓24小時(shí)，達(dá)到飽和狀態(tài)，制備HRS，使氫氣濃度保持在0.6 mmol/L左右，經(jīng)輻照消毒滅菌于4℃保存?zhèn)溆?。HRS需要每周制備以保證氫氣的濃度不低于0.6 mmol/L。

1.3 動(dòng)物分組及干預(yù) 小鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、心肌梗死(MI)組和心肌梗死(MI)+HRS組，每組20只。按照課題組前期的方法建立小鼠心肌梗死模型[7]，小鼠麻醉后，在左側(cè)第3、4 肋間隙擠出心臟，左心耳下緣水平線為標(biāo)志，在線下2 mm處以6-0絲線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立小鼠心肌梗死模型。HRS組于手術(shù)前3小時(shí)開始采用HRS [10 mg/(Kg·d)]腹腔注射小鼠，對(duì)照組和心肌梗死組采用生理鹽水腹腔注射，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.4 小鼠血流動(dòng)力學(xué)、心臟功能的檢測(cè) 參照筆者前期的方法[8]，小鼠麻醉后，采用Visual Sonics小動(dòng)物超聲診斷儀測(cè)定小鼠的左心室射血分?jǐn)?shù)(eject fraction, EF)、左心室內(nèi)徑縮短率(fractional shortening, FS)；采用多導(dǎo)生理記錄儀(PowerLab，澳大利亞AD Instruments公司)測(cè)定小鼠的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，仰臥位消毒、鋪巾，分離右頸動(dòng)脈并插管，插管入左心室后記錄心室壓力曲線，根據(jù)Chart 5軟件計(jì)算左心室收縮期壓力(left ventricular end-systolic pressure, LVESP)、左心室舒張末期壓力(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)、等容收縮期左室內(nèi)壓力上升最大速率(+dP/dt)和等容舒張期左室壓力下降最大速率(-dP/dt)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，取出心臟標(biāo)本，分別凍存于- 80℃冰箱和置于福爾馬林中固定。

1.5 心肌組織病理檢測(cè) 參照課題組前期的方法[9]，各組心肌組織經(jīng)福爾馬林固定后，常規(guī)石蠟切片，行HE染色和Masson染色。用Image-Pro Plus系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測(cè)量出心肌梗死面積占總面積的百分比。

1.6 心肌組織中MDA、SOD、TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1水平測(cè)定 取左心室梗死交界區(qū)組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗后置于勻漿器中，加入1 ml生理鹽水在冰浴中進(jìn)行組織勻漿，勻漿液離心(3000 r/min, 5 min)，取上清液，用于檢測(cè)心肌組織中MDA、SOD、TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1水平。采用黃嘌呤氧化酶(羥胺)法檢測(cè)SOD活性，采用硫代巴比妥酸(TBA)法檢測(cè)MDA水平，采用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)分析TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 HRS對(duì)小鼠心肌梗死后心臟功能的影響 心肌梗死后第21天，心臟超聲和血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)顯示，左心室腔明顯擴(kuò)大，EF和FS顯著降低，LVESP減小，LVEDP明顯增加，+dP/dt明顯減小，-dP/dt明顯增加(P<0.01或P<0.05，表1)，提示小鼠心肌梗死模型建立成功。與MI組相比，HRS可導(dǎo)致心肌梗死小鼠的EF、FS、LVESP、+dP/dt明顯增加，LVEDP、-dP/dt明顯減小(P<0.01或P<0.05，表1)，提示HRS可以明顯改善小鼠心肌梗死后心臟的收縮和舒張功能。

Table 1 Effect of HRS on cardiac function after myocardial infarction in mice

指標(biāo)對(duì)照組MI組MI+HRS組EF(%)53.62±3.6521.18±2.89②32.65±3.66④FS(%)26.79±1.9710.61±1.51②16.31±1.89③LVESP(mmHg)113.63±4.4296.50±4.97①102.25±4.78LVEDP(mmHg)1.78±0.3812.65±0.94②7.40±0.83③dP/dtmax(mmHg/s)4216±2171368±215②2539±325④dP/dtmin(mmHg/s)-3865±198-1151±206②-2016±259④

注：n=10；與對(duì)照組比較，①P<0.05，②P<0.01;與MI組比較，③P<0.05，④P<0.01

2.2 HRS對(duì)小鼠心肌梗死面積、心肌纖維化的影響 心肌梗死后第21天，通過Masson染色的方法測(cè)量心肌梗死面積，并評(píng)估心肌纖維化情況。與MI相比，HRS干預(yù)組的心肌梗死范圍明顯縮小[(38.42 ± 5.26)%vs(22.86±3.17)%，P<0.01，圖1]，梗死交界區(qū)、非梗死區(qū)膠原沉積減少，纖維化程度減輕，而梗死區(qū)發(fā)現(xiàn)有更多的存活心肌細(xì)胞(圖1)，提示HRS可以縮小心肌梗死面積，抑制心梗后心肌纖維化。

圖1 HRS對(duì)小鼠心肌梗死面積、心肌纖維化的影響

Figure 1 Effect of HRS on infarct area size and cardiac fibrosis after myocardial infarction in mice

2.3 HRS對(duì)小鼠非梗死區(qū)心肌肥厚的影響 心肌梗死后第21天，小鼠非梗死區(qū)心肌組織出現(xiàn)代償性心肌肥厚[心肌細(xì)胞面積：(408.5 ± 39.4) μm2vs(275.0±19.2) μm2，P<0.01，圖2]；與MI組相比，HRS干預(yù)組非梗死區(qū)心肌肥厚情況顯著改善[心肌細(xì)胞面積：(344.6±26.3) μm2vs(408.5±39.4) μm2，P<0.01，圖2]，提示HRS可以延緩非梗死區(qū)的心肌肥厚。

2.4 HRS對(duì)小鼠心肌梗死后心肌組織中氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的影響 通過測(cè)量梗死交界區(qū)組織中MDA含量、SOD活性來評(píng)估心肌組織中氧化應(yīng)激的情況，心肌梗死后第5天，梗死交界區(qū)心肌組織中MDA含量明顯增加、SOD活性顯著降低(均P<0.01，圖3)；與MI組相比，HRS干預(yù)組梗死交界區(qū)心肌組織中MDA含量減少、SOD活性降低(P<0.01或P<0.05，圖3)，提示HRS可以減輕心肌梗死后心肌組織中的氧化應(yīng)激。

通過測(cè)量梗死交界區(qū)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1來評(píng)估心肌組織中炎癥反應(yīng)的情況，心肌梗死后第5天，梗死交界區(qū)心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1表達(dá)明顯增加(均P<0.01，圖3)；與MI組相比，HRS干預(yù)組梗死交界區(qū)心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1表達(dá)顯著減少(P<0.01或P<0.05，圖3)，提示HRS可以抑制心肌梗死后心肌組織中的炎癥反應(yīng)。

圖2 HRS對(duì)小鼠非梗死區(qū)心肌肥厚的影響

Figure 2 Effect of HRS on cardiac hypertrophy in non-infarcted myocardium in mice

3 討論

氫是自然界最簡(jiǎn)單的元素，氫氣是無色、無嗅、無味，具有一定還原性的雙原子氣體，學(xué)術(shù)界早期一直認(rèn)為氫氣屬于生理性惰性氣體。2007年，日本學(xué)者Ohsawa I等發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物呼吸2%的氫氣可顯著改善腦缺血再灌注損傷，氫氣可選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子，而后兩者是氧化應(yīng)激損傷的最重要介質(zhì)[3]。該研究迅速引起廣泛關(guān)注，并引起研究氫氣治療疾病的熱潮。2009年，Cai J等最早提出一種含有濃度0.2～1.0 mmol/L氫氣的HRS治療腦缺血導(dǎo)致的組織損傷和器官功能障礙，通過脫氣處理、低溫預(yù)處理、注入純氫氣、加壓助溶等步驟制備的HRS能明顯減少腦梗死面積，減輕組織損傷，減少神經(jīng)組織細(xì)胞凋亡數(shù)量[10]。前期研究發(fā)現(xiàn)，HRS可以明顯減輕急性的心肌缺血再灌注損傷[4, 5]。然而HRS對(duì)心肌梗死后心肌重構(gòu)這一慢性病程的影響尚不清楚。

圖3 HRS對(duì)小鼠心肌梗死后心肌組織中氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的影響

Figure 2 Effect of HRS on oxidative stress and inflammation of peri-infarct myocardium in mice

注：n=10；與對(duì)照組比較，②P<0.01，與MI組比較，①P<0.05

本研究中，我們通過建立小鼠心肌梗死模型發(fā)現(xiàn)，腹腔注射HRS可以明顯改善小鼠心肌梗死后心臟的收縮和舒張功能。心肌重構(gòu)是心肌梗死后慢性心力衰竭的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，主要表現(xiàn)為梗死區(qū)的擴(kuò)展、非梗死區(qū)的心肌細(xì)胞肥大和間質(zhì)異常纖維化，大量研究證實(shí)，抑制心肌重構(gòu)可以明顯延緩心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程[11]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，HRS可以縮小心肌梗死的范圍，可能與其抑制梗死區(qū)的擴(kuò)展有關(guān)。此外，HRS還可以抑制非梗死區(qū)的心肌細(xì)胞肥大和間質(zhì)纖維化。因此，HRS可以通過抑制心梗后心肌重構(gòu)來改善小鼠心臟的收縮和舒張功能。

氧化應(yīng)激是由于心肌缺血缺氧引起心肌細(xì)胞內(nèi)的氧自由基生成增多和(或)清除能力降低，從而導(dǎo)致氧自由基在細(xì)胞內(nèi)蓄積，過多的氧自由基導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，造成細(xì)胞氧化損傷，從而引起心肌細(xì)胞損傷或凋亡；MDA是氧自由基攻擊細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸后生成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，MDA水平間接反映體內(nèi)脂質(zhì)氧化及組織損傷程度；SOD在氧化與抗氧化平衡中起著關(guān)鍵作用，通過清除人體中超氧化物和H2O2，保護(hù)細(xì)胞生物膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性。前期大量研究證實(shí)，氧化應(yīng)激是心肌梗死后心肌重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)[12]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，HRS使得心肌梗死交界區(qū)組織中的MDA減少，SOD活性增加，提示HRS可能通過減輕氧化應(yīng)激水平來抑制心肌重構(gòu)。

心肌梗死后迅速激活固有免疫產(chǎn)生強(qiáng)烈而短暫的炎癥反應(yīng)，清除梗死區(qū)域死亡細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)碎片，是心臟修復(fù)必須的過程。然而心肌梗死后過度的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷、壞死和凋亡，促使梗死范圍的擴(kuò)展，參與了心肌重構(gòu)、心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程[13]。既往研究證實(shí)，TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在心肌梗死后心肌重構(gòu)的過程中發(fā)揮了重要作用[14]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，HRS可使心肌梗死交界區(qū)組織中的TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的表達(dá)明顯減少，提示HRS可能通過減輕過度的炎癥反應(yīng)來抑制心肌重構(gòu)。

值得注意的是，HRS如何調(diào)節(jié)心肌梗死后的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，是通過氫直接中和氧自由基，或者像另一氣體分子硫化氫(H2S)通過相應(yīng)的分子靶點(diǎn)發(fā)揮作用[15]，目前尚不清楚。此外，HRS對(duì)大動(dòng)物、人的心肌梗死后心肌重構(gòu)、心力衰竭的防治效果亦期待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示，HRS可通過抑制心肌重構(gòu)來改善小鼠心肌梗死后的心臟收縮和舒張功能，可能與其減輕氧化應(yīng)激、抑制過度炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果為心肌梗死后心力衰竭的防治提供了新思路。

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Effect of hydrogen-rich saline on cardiac remodeling after myocardial infarction

WANG Qiang,YNAG Yongjian,LI De,etal

(DepartmentofCardiology,ChengduMilitaryGeneralHospital,Chengdu610083,China)

Objective To investigate the effect of hydrogen-rich saline (HRS) on cardiac remodeling after myocardial infarction and explore the underlying mechanisms. Methods Male C57/BL6 mice were randomly divided into control group, myocardial infarction(MI) group and MI plus HRS group (n = 20). After the intervention for 21 days, the haemodynamic data and cardiac function were measured by echocardiography and a physiological recorder. The infarct area, cardiac hypertrophy and myocardial interstitial fibrosis were evaluated by HE and Masson staining. In addition, the oxidative stress and inflammation in the peri-infarct region were also determined. Results Treatment of HRS via intraperitoneal injection improved cardiac diastolic function (P<0.01,P<0.05), reduced infarct area size (P<0.01), inhibited cardiac hypertrophy and myocardial interstitial fibrosis after myocardial infarction.The treatment of HRS increased superoxide dismutase (SOD) activity, decreased malondialdehyde (MDA), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin 1β (IL-1β), interleukin 6 (IL-6) and monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) content in the peri-infarct region. Conclusion HRS may prevent cardiac remodeling and improve cardiac function via attenuating oxidative stress and inflammation.

Myocardial infarction； Cardiac remodeling； Hydrogen； Oxidative stress； Inflammation

國(guó)家自然科學(xué)基金(81170081、81500224)，全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項(xiàng)目(13QNP058)，四川省科技廳科技創(chuàng)新苗子工程培育項(xiàng)目(2015016)

楊永健，教授，博士生導(dǎo)師，本刊常務(wù)編委，E-mail：yangyongjian38@sina.com；李德，主任醫(yī)師，E-mail：lide660809@qq.com

R 542.2+2

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.03.004

2015-12-01； 修回日期： 2015-12-17； 編輯： 母存培)