黃世園，蔣賢遜，沈潔，王小同

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院　腦科、康復中心，浙江　溫州　325027）

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低頻電刺激對低氧高二氧化碳大鼠比目魚肌肌纖維類型的影響

黃世園，蔣賢遜，沈潔，王小同

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院腦科、康復中心，浙江溫州325027）

[摘 要]目的：探討低頻電刺激對低氧高二氧化碳模型大鼠比目魚肌肌纖維類型轉變的影響。方法：成年SD大鼠40只隨機分成4組：正常組10只，捆綁組10只，造模組10只，低頻電刺激組10只。造模組、捆綁組及低頻電刺激組大鼠置于低氧高二氧化碳艙內造模，每次持續(xù)8 h，總共4周。低頻電刺激組在持續(xù)造模2周后，用電刺激儀對大鼠進行30 min，30 Hz，1:1循環(huán)模式的低頻電刺激，低頻電刺激維持2周；捆綁組僅做捆綁及貼電極片處理。HE染色檢測大鼠比目魚肌病理改變，免疫組織化學觀察比目魚肌肌纖維類型轉變，qRT-PCR檢測MHC-I、MHC-IIa/IIx mRNA水平，Western Blot檢測比目魚肌MHC-I、雌激素相關受體γ（ERRγ）、過氧化物酶體增殖物受體β（PPARβ）蛋白含量的變化。結果：相比正常組，捆綁組及造模組大鼠比目魚肌局部炎癥反應明顯，肌纖維橫截面積明顯下降，MHC-I以及PPARβ蛋白含量明顯下降，MHC-I mRNA下降，MHCIIa/IIx mRNA含量升高。相比捆綁組或造模組，低頻電刺激組大鼠比目魚肌局部炎癥反應減輕，MHC-I、ERRγ 及PPARβ蛋白含量明顯增加，MHC-I mRNA含量明顯升高，MHC-IIa/IIx mRNA明顯下降。結論：低氧高二氧化碳可致大鼠比目魚肌MHC-I向MHC-IIa/IIx型纖維轉變，而低頻電刺激可部分逆轉低氧高二氧化碳所致的肌纖維類型轉變。PPARβ、ERRγ蛋白可能參與其中調節(jié)。

[關鍵詞]低氧高碳酸血癥；電刺激；大鼠；比目魚??；肌球蛋白重鏈

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一類以持續(xù)性進行性氣流受限為主要特征的疾病，目前COPD是引起人類死亡的第四大誘因[1]。COPD患者往往伴發(fā)多種并發(fā)癥，其中骨骼肌功能障礙與其高病死率密切相關[2]。COPD患者骨骼肌功能障礙可表現(xiàn)為肌萎縮、肌耐力下降、肌力下降，低氧、氧化應激、廢用、系統(tǒng)性炎癥等都是潛在的致病因素[3-5]。導致肌耐力下降的直接原因是以I型肌纖維為主的慢肌纖維含量下降，這在COPD患者中比較常見[6]。通過電刺激興奮骨骼肌的電刺激療法對于改善COPD患者骨骼肌功能已得到證實[7-8]。不同頻率電刺激對肌肉影響不同，低頻電刺激可模擬支配慢肌纖維的神經(jīng)放電模式，能有效提高慢肌耐力[9]。比目魚肌主要由I型肌纖維組成，其在姿勢維持、步行等方面起重要作用。El-Khoury等通過分離低氧模型大鼠比目魚肌，發(fā)現(xiàn)低氧可引起比目魚肌肌耐力下降[10]，但其具體機制并未明了。本研究采用低氧高二氧化碳大鼠模型，探討低頻電刺激對模型大鼠比目魚肌肌纖維類型的影響。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組：成年SPF級雄性SD大鼠40只，購自溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，初始體質量為160～180 g。將大鼠編號后按照隨機數(shù)表法，分成正常組、捆綁組、造模組、低頻電刺激組，每組10只。

1.1.2儀器：動物實驗復合模擬艙（濰坊華信氧業(yè)有限公司），HANS-200A電刺激儀。

1.2方法

1.2.1低氧高二氧化碳模型建立[11]：將造模組、捆綁組、低頻電刺激組大鼠放入氧艙內飼養(yǎng)，飼料及水充足。選用低氧高二氧化碳模式，維持艙內氧氣濃度在7%～11%，二氧化碳濃度為5%～6%，艙內溫度：22～23 ℃。造模時間為每天8 h，每周6 d，共造模4周，其余時間在正常條件下飼養(yǎng)。對照組置于對照氧艙中飼養(yǎng)（吸入空氣）。

1.2.2電刺激方法：低頻電刺激組在造模2周后進行電刺激。首先剔去大鼠兩側的腓腸肌上的毛發(fā)直至暴露皮膚，再將大鼠固定在捆綁臺上，把電極片捆綁在其兩側腓腸肌，保證電極片與腓腸肌處皮膚充分接觸。電刺激參數(shù)：方波頻率30 Hz，工作循環(huán)1:1，電流強度通過觀察大鼠反應適當調整。每次刺激時間30 min，每周7 d，持續(xù)2周。捆綁組大鼠除了不進行電刺激外，其他處理與低頻電刺激組相同。

1.2.3骨骼肌分離提取：配置10%的水合氯醛，稱量每只大鼠的體質量后，按照0.4 mL/100 g的劑量，經(jīng)腹腔注射麻醉藥，待大鼠進入麻醉狀態(tài)后，迅速地分離其腓腸肌以及比目魚肌，解剖位置參考Armstrong的研究[12]。分離后的組織一部分迅速放入配置好的4%多聚甲醛固定液中固定24 h，后經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、透蠟、包埋。另一部分組織不經(jīng)處理迅速放入-80 ℃冰箱保存。大鼠最后經(jīng)過量的水合氯醛注射處死，實驗過程符合實驗動物倫理學標準。

1.2.4骨骼肌組織HE染色：經(jīng)石蠟包埋后的骨骼肌，用石蠟切片機（Leica）切片，厚度為3 μm，切片放入60 ℃烤箱烤片1 h，再放入二甲苯中脫蠟15 min，重復2次，隨后經(jīng)梯度酒精復水，進行HE染色。染色的試劑盒購自碧云天（C0105）。蘇木素染色7 min后，置入自來水中清洗6 min，隨后用伊紅染色37 s，梯度酒精脫水后置入二甲苯內透明15 min，最后用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察。隨機在各組中選取5張切片，每張切片再隨機選擇5個視野，視野內各肌纖維橫截面積大小通過Image J軟件分析得出。

1.2.5免疫組織化學染色方法：選取4 μm的石蠟切片，放入60 ℃烤箱中烤片3 h，后放入二甲苯中脫蠟40 min，然后經(jīng)梯度酒精復水，再將切片放入已經(jīng)配置的枸櫞酸鈉（中杉金橋）緩沖液中，后將緩沖液放入已煮沸的高壓鍋內進行抗原修復，維持12 min。修復完成后，將緩沖液合并切片在常溫下自然冷卻，將切片放入PBS中洗3次，每次5 min，然后用10%山羊血清封閉2 h，甩凈切片上的山羊血清，最后滴加MHC-I抗體，抗體濃度為1:4 000，4 ℃孵育過夜；第2天先用PBS清洗切片3次，每次5 min，然后根據(jù)免疫組織化學二抗試劑盒（中杉PV9002）操作步驟，先用10%過氧化氫封閉內源性過氧化氫酶10 min，經(jīng)PBS清洗后用聚合物輔助劑孵育20 min，PBS清洗后孵育二抗30 min，用DAB顯色液顯色，最后用Olympus顯微鏡觀察并攝取相應圖片。

1.2.6Western Blot法：取70 mg的比目魚肌充分剪碎，放入裝有PMSF和RIPA混合液（PMSF:RIPA=1:99）的勻漿管內，將勻漿管置于勻漿器上勻漿，放置于冰上靜置20 min，用離心機以3 000 r/min，4 ℃下離心5 min，經(jīng)過超聲裂解后，再經(jīng)12 000 r/min離心20 min，吸取上清，放入-80 ℃冰箱保存。蛋白上樣體系配置：先用BCA試劑盒（碧云天）測定蛋白濃度，加雙蒸水及Loadingbuffer配置成上樣體系。配置好后經(jīng)100 ℃ 5 min將體系變性，放入-20 ℃冰箱保存。電泳時選用8%分離膠進行蛋白分離，后濕轉至PVDF膜（Millipore）。轉膜結束后，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗后，放入經(jīng)稀釋的MHC-I（Anti-Slow Skeletal Myosin Heavy chain，ab11083），雌激素相關受體γ（ERRγ，Abcam，ab128930），過氧化物酶體增殖物受體β（PPARβ，Santa Cruz，H-74）一抗中4 ℃孵育過夜，抗體稀釋濃度分別為1:2 500，1:2 000，1:200；MHC-I蛋白二抗選用山羊抗小鼠（Biosharp），PPARβ、ERRγ二抗選用山羊抗兔，分別室溫孵育2 h，二抗?jié)舛?:2 000；內參Tubulin來自碧云天公司，稀釋倍數(shù)為1:2 000，二抗選用山羊抗小鼠（Biosharp）室溫孵育2 h，二抗?jié)舛?:2 000。

1.2.7qRT-PCR RNA抽提方法：取150 mg組織研磨后加1 mL Trizol（Invitrogen）抽提試劑加入200 μL氯仿/異戊醇（24:1），振蕩混勻30 s，放置5 min；用高速冷凍離心機，12 000 r/min，4 ℃離心10 min；將上清液小心轉移到去酶的1.5 mL離心管里，加入與上清等體積的異丙醇和1.0 μL的糖原，室溫下放置5 min；再經(jīng)過高速冷凍離心機離心8 min （12 000 r/min，4 ℃）；移去上清液，用70%酒精洗滌2次，每次700 μL，再分別離心2 min和5 min （12 000 r/min，4 ℃）；待酒精揮發(fā)完全后，用15 μL DEPC-H2O溶解RNA。反應體系包括：0.1 mol/L DTT（Invitrogen）2 μL，40 U/μL Rnasin（Promega）0.5 μL，10 mmol/L dNTP（Takara）1.0 μL；Random Primer 1.0 μL，5×first Strand Buffer 4.0 μL，5 U/μL DnaseI（Takara）1.0 μL，RNA 10.5 μL。反轉錄：先放入冰中浴5 min，后加入40 U/μL RNasin 0.5 μL，200 U/μL SSII 0.5 μL。反應程序為：25 ℃（10 min），42 ℃（1 h），52 ℃（15 min），70 ℃（15 min）。Real-time PCR：反應體系25 μL，包括：5×R-PCR Buffer（5.0 μL），250 mmol/L Mg2+（0.3 μL），10 mmol/L dNTP（0.75 μL），10 μmol/L上游引物（0.5 μL），10 μmol/L下游引物（0.5 μL），25×SYBR GreenI（Bio-Rad，1.0 μL），10-3×Calibration（Bio-Rad，1.0 μL），5 U/μL HS-Ex-Taq（Takara，0.25 μL），ddH2O（14.7 μL），cDNA（1.0 μL）。反應程序：95 ℃（90 s），95 ℃（5 s），58 ℃（30 s）共40個循環(huán)，產(chǎn)生熒光信號監(jiān)測點。然后5 ℃（1 min），58 ℃（1 min），58 ℃（10 s）。

1.3統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用±s表示，用x2檢驗比較各組比目魚肌肌纖維構成比，各組間肌纖維截面積及Western blot、PCR數(shù)值比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.14組比目魚肌病理形態(tài)比較 正常組大鼠肌細胞形態(tài)飽滿，排列有序，細胞核大小正常，見圖1A；與正常組比，造模組及捆綁組，骨骼肌局部炎癥反應明顯，肌細胞核肥大，肌間質纖維化，大量形狀異常的肌細胞；造模組、捆綁組和低頻電刺激組肌纖維橫截面積明顯變??；與造模組和捆綁組比，低頻電刺激組大鼠比目魚肌周圍血管數(shù)目增加，肌細胞形態(tài)正常，見圖1和表1。

2.24組肌纖維類型構成比較 與正常組比，造模組和捆綁組大鼠比目魚肌I型肌纖維數(shù)量明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2和表2；與造模組和捆綁組比，低頻電刺激組大鼠比目魚肌I型肌纖維數(shù)目明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2和圖2。與正常組比，捆綁組和造模組大鼠比目魚肌MHC-I mRNA明顯下降，MHC-IIa、MHC-IIx mRNA明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而低頻電刺激組，大鼠比目魚肌MHC-I mRNA含量相比捆綁組和造模組明顯升高（P＜0.05），而MHC-IIa、MHC-IIx mRNA含量明顯下降（P＜0.05）。

圖1　比目魚肌HE染色（×200）

表1　4組比目魚肌平均截面積（n=5，±s，μm2）

表1　4組比目魚肌平均截面積（n=5，±s，μm2）

與正常組比：aP＜0.05

組別　平均截面積正常組　958.8± 76.0造模組　715.2±109.7a捆綁組　659.6± 27.5a低頻電刺激組　701.5± 61.7a

2.34組MHCI及其上游調節(jié)蛋白表達比較 造模組和捆綁組大鼠比目魚肌MHC-I、PPARβ蛋白含量比正常組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；4組ERRγ表達水平差異沒有統(tǒng)計學意義；與造模組和捆綁組比，低頻電刺激組大鼠比目魚肌MHC-I、PPARβ、ERRγ蛋白含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖2　4組免疫組織化學I型肌纖維染色（×200）

表2　4組比目魚肌各型肌纖維相對mRNA含量（n=5，±s）

表2　4組比目魚肌各型肌纖維相對mRNA含量（n=5，±s）

與正常組比：aP＜0.05；與造模組和捆綁組比：bP＜0.05

組別　MHC-I　MHC-IIa　MHC-IIx正常組　0.825±0.043a　0.373±0.014a　0.399±0.016a捆綁組　0.417±0.023a　0.817±0.015a　0.838±0.320a造模組　0.402±0.016a　0.835±0.025a　0.825±0.013a低頻電刺激組　0.878±0.047b　0.402±0.016b　0.397±0.015b

圖3　4組大鼠比目魚肌各型肌纖維相對mRNA含量

圖4　4組大鼠比目魚肌中各蛋白Western Blot結果

3　討論

COPD的肺外并發(fā)癥在近年受到了越來越多的重視，諸多并發(fā)癥中，因骨骼肌功能障礙與患者病死率密切相關，因而受到了關注。低頻電刺激可有效促進骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖[13]，增加COPD患者骨骼肌I型肌纖維含量[8]，然而其對COPD患者骨骼肌功能的影響以及具體機制仍不十分明確。本研究發(fā)現(xiàn)：低氧高二氧化碳可引起大鼠比目魚肌損傷及I型肌纖維向IIa/IIx轉化，而低頻電刺激可有效逆轉該過程。低氧高二氧化碳及低頻電刺激對比目魚肌肌纖維形態(tài)及肌纖維類型的影響可能與ERRγ、PPARβ蛋白表達改變有關。

引起慢性低氧高二氧化碳模型大鼠比目魚肌骨骼肌功能障礙的因素可有很多，通常認為骨骼肌炎癥反應是重要誘因之一[14]。COPD患者骨骼肌炎癥反應可能與其血液循環(huán)中白細胞含量增加有關[15]，而肌細胞核肥大、肌間質纖維化均可因局部肌肉炎癥引起[16]，骨骼肌的炎癥反應還與骨骼肌萎縮的發(fā)生關系密切[17]。骨骼肌橫截面積與COPD患者運動能力呈現(xiàn)明顯的正相關；同時輕癥COPD患者，也可出現(xiàn)較明顯的骨骼肌萎縮及運動能力下降[18]。本研究中模型大鼠肌纖維橫截面積相比正常組明顯下降，可能因大鼠長期暴露于低氧環(huán)境所致[19]，但也可能由炎癥反應等其他因素引起。不過，De Theije建立的低氧模型小鼠卻并未發(fā)現(xiàn)比目魚肌肌纖維橫截面積有明顯改變[20]，產(chǎn)生不同結果的原因可能與建模方式有關。此外，我們觀察到低頻電刺激未明顯增加模型大鼠肌纖維截面積，這表明低頻電刺激尚不能逆轉慢性低氧高二氧化碳所致模型大鼠比目魚肌萎縮。

I型肌纖維線粒體含量十分豐富，且其能量代謝以有氧代謝為主，故其抗疲勞能力較強。II型纖維的供能方式為無氧酵解混合有氧代謝（IIa、IIx纖維）或者純無氧酵解（IIb纖維），故其抗疲勞能力相對弱。骨骼肌各纖維的組成比并非一成不變，當受到低氧、廢用或耐力運動等外界因素干預時，不同類型的肌纖維之間可互相轉化，進而使肌肉功能能夠適應外界環(huán)境的變化，保持相應的工作狀態(tài)。本研究中，低氧高二氧化碳暴露后大鼠比目魚肌I型肌纖維明顯減少，而IIa/IIx型肌纖維含量明顯升高，這表明低氧高二氧化碳可造成大鼠比目魚肌由I型纖維向IIa/IIx這兩類中間型肌纖維轉化。而當采取低頻電刺激大鼠比目魚肌后，我們發(fā)現(xiàn)其I型肌纖維含量有明顯升高，同時伴隨IIa/IIx型肌纖維含量明顯下降。這表明，低頻電刺激可成功逆轉由低氧高二氧化碳所致的大鼠比目魚肌肌纖維類型轉變。

為了進一步探討造模及低頻電刺激引起肌纖維類型轉變的可能機制，我們還研究了PPARs。PPARs是核激素受體家族中的配體激活受體，其有三個亞型，分別是PPARα、PPARβ、PPARγ。研究發(fā)現(xiàn)，低氧處理的C2C12細胞，其PPARβ mRNA水平明顯下降[21]。Gan等[22]通過建立運動小鼠模型發(fā)現(xiàn)PPARβ與小鼠骨骼肌I型肌纖維的表達密切相關，并且PPARβ是通過直接激活ERRγ實現(xiàn)的。ERRγ屬于核受體（nuclear receptor，NR）超家族的一員，是一種在慢肌纖維內豐富表達的蛋白。研究表明，ERRγ在調控骨骼肌纖維類型、線粒體功能、血管生成方面起重要作用[23]。本研究中模型組動物比目魚肌PPARβ水平相比正常組明顯下降，然而比目魚肌ERRγ水平卻沒有明顯改變，這與其I型肌纖維含量的改變并不平行，為此我們通過相關文獻查閱發(fā)現(xiàn)：研究ERRγ蛋白過表達處理后的比目魚肌發(fā)現(xiàn)比目魚肌I型肌纖維含量并沒有明顯改變[24]，同樣ERRγ敲除后小鼠比目魚肌I型肌纖維同樣沒有明顯改變[22]，這表明ERRγ可能并未參與比目魚肌I型肌纖維的調節(jié)，PPARβ則可能是直接或間接地通過其他通路來調節(jié)比目魚肌肌纖維類型。前期鮮有研究關注低頻電刺激對骨骼肌ERRγ表達的影響，本研究顯示，低頻電刺激可顯著提高骨骼肌ERRγ的表達，同時，其上游蛋白PPARβ的水平亦有明顯的升高。然而考慮到ERRγ可能并未參與到比目魚肌I型肌纖維的調控，為此我們猜測低頻電刺激引起的I型肌纖維含量上升可能與PPARβ的水平升高有關。盡管ERRγ未參與調節(jié)比目魚肌I型肌纖維，但低頻電刺激后其含量亦明顯增加，結合觀察到該組大鼠比目魚肌內血管數(shù)目有所增加，我們猜測低頻電刺激很有可能是增加了ERRγ表達進而促進了比目魚肌的血管生成，但確切機制仍有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，低頻電刺激可逆轉因低氧高二氧化碳所致的I型纖維向II型纖維轉化，其機制可能與PPARβ蛋白含量升高有關，而ERRγ則可能與低頻電刺激誘導的血管增生有關。

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（本文編輯：吳彬）

·論著·

Effect of low frequency electrical stimulation on soleus muscle fiber type of hypoxia-hypercapnia rats

HUANG Shiyuan,JIANG Xianxun,SHEN Jie,WANG Xiaotong.Center of Neurology and Rehabilitation,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Abstract:Objective:To explore the effect of low frequency electrical stimulation on transition of rats’ soleus muscle fibre type after the long term chronic hypoxia-hypercapnia exposure.Methods:Forty male Sprague Dawley rats were randomly divided into four groups:the Normal Control (NC),Hypoxia-hypercapnia (HH),Hypoxia-hypercapnia+Tie-up (HT) and Low-frequency electrical stimulation (LFES).The HH,HT and LFES were placed in a chamber with hypoxia-hypercapnia for 8 h/d,4 weeks in all.After 2 weeks,30 min,30 Hz,1:1 cycle electrical stimulation was applied in the LEFS,this procedure lasted 2 weeks.The HT were only tied up and placed with electrode plates.Hematoxylin and Eeosin staining was used to observe pathological change of soleus muscle.Soleus fiber composition was visualized with immunochemistry,qRT-PCR was used to detect mRNA levels of MHC-I,MHC-IIa and IIx.Proteins expression of MHC-I,ERRγ,PPARβ was tested by Western Blot.Results:Increased inflammation cells and MHC-IIa/IIx mRNA,decreased cross section area,MHC-I,PPARβ protein and MHC-I mRNA were found in the HH and HT group compared with the NC.Compared with the HH and HT respectively,inflammation cells and MHC-IIa/IIx mRNA level were decreased,while mRNA level of MHC-I and protein expression of MHC-I,ERRγ and PPARβ were significantly increased after LFES.Conclusion:Hypoxia-hypercapnia leads to soleus muscle transition of MHC-I into MHC-IIa/IIx.However,LFES may reverse the muscle fiber transition induced by HH.PPARβ and ERRγ may have participates in this process.

Key words:hypoxia-hypercapnia; electrical stimulation; rats; soleus; myosin heavy chain

通信作者：王小同，教授，碩士生導師，Email：wangxt22@163.com。

作者簡介：黃世園（1991-），男，浙江臺州人，碩士生。

基金項目：浙江省自然科學基金資助項目（Y2080503）。

收稿日期：2015-07-26

[中圖分類號]R337.5

[文獻標志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.03.001