李繼友（天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300400）

基于p21啟動(dòng)子報(bào)告基因系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用

李繼友
（天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300400）

本研究通過構(gòu)建p21啟動(dòng)子報(bào)告基因系統(tǒng)，進(jìn)行篩選能夠上調(diào)p21表達(dá)的有效中藥制劑，最終闡明其基本抗腫瘤機(jī)理。

啟動(dòng)子；報(bào)告基因系統(tǒng)；構(gòu)建

p21基因是重要的腫瘤抑制基因p53的靶基因，在細(xì)胞受內(nèi)外環(huán)境脅迫的情況下，轉(zhuǎn)錄因子p53蛋白表達(dá)量升高，p53可以調(diào)節(jié)大量蛋白的表達(dá)，從而使細(xì)胞周期阻滯在G1/S期。p21可以以p53依賴和非依賴的方式表達(dá)升高，p21可以結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK2和CDK4/6，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。多種放療和化療藥物治療腫瘤的機(jī)制就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)p21表達(dá)升高，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，從而抑制腫瘤生長。

中藥是我們國家的瑰寶，許多藥物已經(jīng)被用于治療不同類型的腫瘤，取得了良好的效果。但是其治療腫瘤的機(jī)制不明，限制了其應(yīng)用和發(fā)展。我們構(gòu)建了p21啟動(dòng)子報(bào)告基因系統(tǒng)，用于篩選能夠上調(diào)p21表達(dá)的有效中藥制劑，進(jìn)而闡明其抗腫瘤機(jī)理。

1材料與方法

1.1主要試劑

DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（Hy?clone公司），Lipofectamine 2000（Invitrogen公司），G418（Calbiochem公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光素酶單報(bào)告檢測系統(tǒng)試劑盒（Promega公司），PCR反應(yīng)中的Premix ExTaq和DNA Marker（Takara公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

本論文中所用到的細(xì)胞系包括人胚腎細(xì)胞系293和宮頸癌細(xì)胞HeLa均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫。細(xì)胞用含10%胎牛血清、100μ g/ mL鏈霉素的DMEM（Hyclone）培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用含0.02%EDTA的胰酶消化細(xì)胞并進(jìn)行傳代[1]。

1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建

WWP-Luc-1由Vogelstein博士(Johns Hopkins University, Baltimore, MD)提供[2]，它包含有2.3kb的p21啟動(dòng)子片段，利用HindIII單酶切后連入pGL3-Enhancer載體上。然后用BglII和XbaI將該載體上的p21啟動(dòng)子和熒光素酶基因酶切后連接到pCI-neo載體上。純化后的得到pCI-p21-luc-neo用于轉(zhuǎn)染（如圖1）。

圖1 pCI-p21-luc-neo質(zhì)粒圖譜

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選

24孔板中每孔加入500μLDMEM培養(yǎng)基，接種5× 104個(gè)293細(xì)胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。采用Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染pCI-p21-luc-neo，每孔加入100μL脂質(zhì)體-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染混懸液（含質(zhì)粒DNA 0.4μg，Lipofectamine 2000 1μL），繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后胰酶消化，轉(zhuǎn)移至10cm培養(yǎng)皿中；每皿加入含0.5mg/ mLG418的DMEM培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)5d后，更換含G418的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)得到單克隆[2]。

1.2.4熒光素酶報(bào)告基因檢測

應(yīng)用熒光素酶單報(bào)告檢測系統(tǒng)試劑盒來檢測。利用Turner Designs TD20/20光度計(jì)的單熒光素酶實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)模式來測定熒光素酶活性。用裂解液裂解細(xì)胞，加入熒光素酶的底物并檢測其活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

1.2.5總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄PCR

利用Invitrogen公司的Trizol試劑提取總RNA，并利用Promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，得到cDNA。

1.2.6 PCR及瓊脂糖凝膠電泳

以上述cDNA為模板，p21特異性引物（sense：5 ’- GGATGTCCGTCAGAACCC- 3’；antisense：5’-GCTCCCAGGCGAAGTCA-3’）和β-actin特異性引物（sense: 5’-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’；an?tisense：5’-ATGCCAGGGTACATGGTGGT-3’）進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 p21啟動(dòng)子報(bào)告基因系統(tǒng)的建立和鑒定：我們篩選到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p21啟動(dòng)子的293細(xì)胞（293-p21），然后對該細(xì)胞進(jìn)行鑒定。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，去乙?；敢种苿㏕SA，中藥甘草次酸均可以有效的誘導(dǎo)p21的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，用這兩種藥物處理293-p21細(xì)胞24h后，利用熒光素酶報(bào)告基因檢測，與對照相比，兩種藥物均可以顯著誘導(dǎo)p21的啟動(dòng)子活性（圖2）。證明我們成功構(gòu)建了藥物篩選的系統(tǒng)。

圖2

2.2篩選有效上調(diào)p21啟動(dòng)子活性的中藥：我們利用構(gòu)建的293-p21篩選系統(tǒng)，對多種可能具有抗腫瘤活性的中藥進(jìn)行了檢測。我們用不同濃度的中藥處理細(xì)胞，24h后進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測，我們成功的檢測到中藥2號可以在低濃度的條件下顯著誘導(dǎo)p21的啟動(dòng)子活性（圖3）。表明中藥2號可能通過上調(diào)p21水平發(fā)揮功能。

圖3

2.3陽性藥物上調(diào)p21 mRNA水平：為了進(jìn)一步確定我們所篩選到的藥物可以上調(diào)p21水平，我們用中藥2號和TSA分別處理腫瘤細(xì)胞HeLa，24h后提取細(xì)胞的總mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用得到的cDNA為模板，p21基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，我們發(fā)現(xiàn)和陽性對照藥物TSA一樣，中藥2號可以顯著上調(diào)腫瘤細(xì)胞中p21 mRNA的表達(dá)（圖4）。

圖4

3 討論

我們成功構(gòu)建了一個(gè)基于p21基因啟動(dòng)子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，由于p21是多種脅迫抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)基因，很多的腫瘤藥物均可以誘導(dǎo)p21的表達(dá)。我們得到的系統(tǒng)經(jīng)過驗(yàn)證，可以有效地被已知的抗腫瘤藥物進(jìn)行誘導(dǎo)，證實(shí)該系統(tǒng)可以作為篩選陽性藥物的有效工具。

中藥及中藥制劑已經(jīng)被越來越多的用于各種疑難雜癥例如腫瘤的治療，并取得了良好的療效。但是在靶向治療、精準(zhǔn)醫(yī)療的大環(huán)境下，由于其成分復(fù)雜，作用機(jī)制不清等原因，局限了中藥的應(yīng)用。我們所得到的篩選系統(tǒng)可以有效的篩選通過p21途徑抑制細(xì)胞增殖的中藥，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

我們利用該篩選系統(tǒng)，成功的篩選到一個(gè)中藥可以有效的誘導(dǎo)p21啟動(dòng)子活性，同時(shí)可以在mRNA水平誘導(dǎo)p21的表達(dá)，我們還將進(jìn)一步對該藥物進(jìn)行分離純化，得到更有效的單體成分，并用于腫瘤的治療。

［1］盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)（第二版）[M].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社, 1999.

［2］J.薩姆布魯克,拉塞爾主編, D W,黃培堂等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版[M].北京：科學(xué)出版社, 2002.

10.3969/j.issn.1008-1267.2016.02.006

R730

A

1008-1267（2016）02-0017-03

2015-12-20

李繼友（1961－）男，副教授，高級工程師，主要從事化工專業(yè)教學(xué)與科研管理工作。