蘇建偉　蔣旗　黃桂柳　鄧志華　胡高?！≈芟矟h　王統(tǒng)華

[摘要]目的 探討苦參堿對結(jié)腸癌耐藥細胞化療藥物敏感性及自噬水平的影響。方法 分別采用濃度為0.5mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml苦參堿作用于結(jié)腸癌細胞HCT-8/VCR，分別在24 h、48 h，采用CCK-8法檢測苦參堿對結(jié)腸癌細胞HCT-8及其耐藥細胞HCT-8/VCR的抑制作用，并計算出抑制率：運用Western Blotting檢測自噬相關(guān)基因P62、Beclin-1、LC3蛋白表達。采用流式細胞術(shù)檢測苦參堿作用耐藥細胞后的細胞凋亡率。結(jié)果在苦參堿作用24 h和48 h后，HCT-8細胞增殖的抑制作用隨著苦參堿濃度的增加而增強，苦參堿對HCT-8細胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。對各組細胞的凋亡率檢測發(fā)現(xiàn)，采用苦參堿的實驗組的細胞凋亡率大大高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。在苦參堿應用24 h后，HCT-8/VCR細胞質(zhì)中出現(xiàn)了自噬泡。Western Blotting檢測顯示隨著苦參堿濃度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表達水平也隨之增強。結(jié)論苦參堿能夠提高結(jié)腸癌耐藥細胞的自噬水平，逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐藥細胞HCT-8/VCR的多藥耐藥性，誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖。

[關(guān)鍵詞]苦參堿；結(jié)腸癌；耐藥細胞化療藥物敏感型；自噬水平

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率一直居高不下。結(jié)腸癌患者死亡率高的主要原因是化療過程中細胞對藥物的耐藥性。結(jié)腸癌細胞的細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核等作用及結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導致化療藥物的敏感性降低，從而產(chǎn)生耐藥性。常見的耐藥途徑如抗凋亡、藥物靶點或代謝酶改變、自噬及結(jié)腸癌細胞過度增殖等都是化療藥物產(chǎn)生抗藥性的主要機制。許多學者對多藥耐藥性的抑制劑進行了長久的探索，近年來中醫(yī)藥抗腫瘤作用的研究備受關(guān)注，尤其在逆轉(zhuǎn)化療耐藥方面?？鄥A是由豆科植物類提取的生物堿，具有抗腫瘤、抗肝纖維化、治療病毒性肝炎、心肌炎等作用，但在結(jié)腸癌自噬方面研究相對較少。本研究觀察苦參堿對結(jié)腸癌耐藥細胞的化療藥物敏感性及自噬水平的影響，旨在為臨床應用苦參堿干預腫瘤機理提供依據(jù)。

1.資料與方法

1.1實驗儀器 超凈工作臺、CO2恒溫培養(yǎng)箱、電熱干燥箱、高壓蒸汽消毒器、冰箱、液氮容器、濾器、真空泵、顯微鏡、天平、高速低溫離心機、恒溫水浴鍋、勻漿器、電泳儀、電泳槽、微波爐、平底燒瓶、凝膠成像儀等儀器。

1.2實驗方法

1.2.1CCK-8法檢測 取對數(shù)生長期的HCT-8/VCR、HCT-8細胞，按細胞傳代方法制備細胞懸液，并進行細胞計數(shù)，將2組細胞接種于96孔板，實驗組加入化療藥長春新堿及5-FU、阿霉素（ADM），空白對照及陰性組加等體積培養(yǎng)液。培養(yǎng)一段時問后觀察細胞株的耐藥情況。

1.2.2CCK-8法檢測苦參堿干預后HCT-8/VCR細胞藥敏性的變化 根據(jù)耐藥細胞株HCT-8/VCR的多藥耐藥性的實驗結(jié)果.制備HCT-8/VCR+Ma細胞。各取1瓶處于對數(shù)生長期的HCT-8/VCR及HCT-8/VCR+Ma細胞，每組分為實驗組、陰性對照組及空白對照組。以藥物濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標繪制濃度效應曲線.求回歸方程.得出50%抑制濃度（IC50）。計算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)：逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=耐藥細胞IC50/Ma作用后耐藥細胞IC50。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測苦參堿作用耐藥細胞后的細胞凋亡率 取對數(shù)生長期的HCT-8/VCR及HCT-8細胞，將2組細胞接種于6孔板，每組細胞分別設(shè)2個組：對照組、實驗組，實驗組中加入上述適宜濃度的Ma，對照組不經(jīng)任何處理。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，實驗組加人不同濃度的化療藥長春新堿.對照組中的耐藥組加入同濃度、等量長春新堿，對照組的親本細胞組不做任何處理作為陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出細胞用FCM法檢測細胞凋亡率。

1.2.4Western Blotting檢測自噬相關(guān)基因P62、Beclin-1、LC3蛋白表達 取處于生長期的HCT-8/VCR，分到2個培養(yǎng)瓶培養(yǎng)48 h，1瓶為實驗組，加人無毒性濃度的Ma.1瓶為陰性對照組.加人等量培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用RIPI細胞裂解液裂解細胞，收集蛋白質(zhì)樣品，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。之后對兩組細胞進行轉(zhuǎn)膜、SDS-PAGE電泳、封閉與雜交，最后曝光鑒定自噬相關(guān)基因的表達。

1.2.5MDC法檢測單用長春新堿或苦參堿或者兩者聯(lián)合應用后自噬囊泡的形成 按照實驗分組進行細胞培養(yǎng)，干預48 h后，用PBS洗2次，加適量0.05mmo]/L的MDC染液于37℃溫育1 h.4%多聚甲醛固定15 min.棄甲醛晾干后.熒光顯微鏡下觀察細胞自噬囊泡的形成情況，計數(shù)，拍照。

1.3評價指標 （1）在全自動酶標儀上于490 nm波長處測定光密度（optical density，OD）值，計算5個復孔平均OD值.計算Ma作用48 h后對HCT-8/VCR、HCT-8細胞的抑制率（inhibition rate，IR）。計算公式：IR（%）=[1-（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（陰性對照組OD值-空白對照組OD值）]×100%。不同濃度的抑制率分別為5個復孔細胞抑制率的平均值；（2）對照組和實驗組的細胞凋亡率分別為6個孔細胞凋亡率的平均值。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組方差齊性采用t檢驗，兩組方差不齊采用t檢驗。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA），兩兩比較采用q檢驗（Newman-Keuls法），檢驗水準：a=0.05，雙側(cè)檢驗。

2.結(jié)果

2.1苦參堿的不同濃度對HCT-8/VCR細胞增殖的抑制率 在苦參堿作用24 h和48 h后，苦參堿對HCT-8細胞增殖有抑制作用且其抑制作用會隨著苦參堿濃度的增加而增強。與濃度為0.5 mg/ml相比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。見表1。

2.2FCM檢測苦參堿作用后兩組細胞HCT-8/VCR的凋亡率比較 運用FCM方法對各組細胞的凋亡率進行檢測發(fā)現(xiàn).采用苦參堿的實驗組的細胞凋亡率大大高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），說明苦參堿可以誘導細胞的凋亡。見表2。

2.3Western Blotting檢測結(jié)果 在苦參堿應用24 h后，HCT-8/VCR細胞質(zhì)中出現(xiàn)了帶有細胞器的泡狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)確認為自噬泡。Western Blotting檢測顯示隨著苦參堿濃度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表達水平也隨之增強。

3.討論

近年來有關(guān)中醫(yī)藥治療肝癌的研究取得較大進展，成為臨床實驗研究熱點之一，中藥因其低毒、高效與多階段性作用的優(yōu)勢，已在腫瘤化療耐藥逆轉(zhuǎn)方法的研究中逐步受到重視?？鄥A（Matrine）是一種從我國傳統(tǒng)中藥苦參、廣豆根中提取的生物堿。前期研究表明苦參堿對結(jié)腸癌患者的恢復有促進作用.它可以使hTERT表達下調(diào).抑制結(jié)腸癌細胞增殖和端粒酶活性，誘導細胞凋亡。本研究運用苦參堿對結(jié)腸癌細胞HCT-8/VCR進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦參堿具有抗腫瘤的藥理活性，能抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、增殖、誘導其凋亡及向正常細胞分化?？鄥A作用24 h和48 h，HCT-8細胞增殖的抑制作用隨著苦參堿濃度的增加而增強.對HCT-8細胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性。運用FCM方法對各組細胞的凋亡率進行檢測發(fā)現(xiàn)，采用苦參堿的實驗組的細胞凋亡率大大高于對照組，說明苦參堿可以誘導細胞的凋亡，抑制結(jié)腸癌細胞增殖。在苦參堿應用24 h后，HCT-8/VCR細胞質(zhì)中出現(xiàn)了帶有細胞器的泡狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)確認為自噬泡?？鄥A是一類獨特的生物堿，具有抗肝纖維化、抗腫瘤、治療病毒性肝炎、心肌炎等作用，近年來其抗腫瘤作用的研究備受關(guān)注，尤其在逆轉(zhuǎn)化療耐藥方面。自噬在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用。自噬可以使結(jié)腸癌細胞的適應凋亡刺激、耐受侵襲性以及營養(yǎng)缺乏的能力提高，在某種程度下會引起結(jié)腸癌的發(fā)生。有研究證實：在早期和進展期結(jié)腸癌中關(guān)鍵蛋白LC3和Beclin-1表達升高，使結(jié)直腸癌核心部位細胞可以耐受營養(yǎng)缺乏和缺氧。誘導腫瘤細胞凋亡是化療藥物殺傷腫瘤細胞的主要途徑，是促進患者化療成功的重要因素。在大多數(shù)情況下，自噬與結(jié)腸癌細胞耐藥性密切相關(guān)，抑制自噬就可以增加結(jié)腸癌細胞對化療藥物的敏感性，提高患者的化療效果。以往實驗結(jié)果表明在LC3細胞形態(tài)學、染色等方面苦參堿能夠誘導結(jié)腸癌細胞發(fā)生自噬。我們用Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)隨著苦參堿濃度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表達水平也隨之增強，與上述文獻結(jié)果相一致。本研究對苦參堿在結(jié)腸癌自噬方面也進行了分析，為臨床應用苦參堿干預腫瘤機理提供依據(jù)，但此次研究仍存在樣本例數(shù)較少等諸多不足，有必要擴大樣本例數(shù)進一步觀察。

綜上所述，苦參堿能夠提高結(jié)腸癌耐藥細胞的自噬水平，逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐藥細胞HCT-8/VCR的多藥耐藥性，誘導細胞的凋亡，抑制細胞的增殖，為臨床應用苦參堿抗腫瘤提供理論依據(jù)。

蘇建偉　蔣旗　黃桂柳　鄧志華　胡高裕　周喜漢　王統(tǒng)華

[摘要]目的 探討苦參堿對結(jié)腸癌耐藥細胞化療藥物敏感性及自噬水平的影響。方法 分別采用濃度為0.5mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml苦參堿作用于結(jié)腸癌細胞HCT-8/VCR，分別在24 h、48 h，采用CCK-8法檢測苦參堿對結(jié)腸癌細胞HCT-8及其耐藥細胞HCT-8/VCR的抑制作用，并計算出抑制率：運用Western Blotting檢測自噬相關(guān)基因P62、Beclin-1、LC3蛋白表達。采用流式細胞術(shù)檢測苦參堿作用耐藥細胞后的細胞凋亡率。結(jié)果在苦參堿作用24 h和48 h后，HCT-8細胞增殖的抑制作用隨著苦參堿濃度的增加而增強，苦參堿對HCT-8細胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。對各組細胞的凋亡率檢測發(fā)現(xiàn)，采用苦參堿的實驗組的細胞凋亡率大大高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。在苦參堿應用24 h后，HCT-8/VCR細胞質(zhì)中出現(xiàn)了自噬泡。Western Blotting檢測顯示隨著苦參堿濃度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表達水平也隨之增強。結(jié)論苦參堿能夠提高結(jié)腸癌耐藥細胞的自噬水平，逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐藥細胞HCT-8/VCR的多藥耐藥性，誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖。

[關(guān)鍵詞]苦參堿；結(jié)腸癌；耐藥細胞化療藥物敏感型；自噬水平

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率一直居高不下。結(jié)腸癌患者死亡率高的主要原因是化療過程中細胞對藥物的耐藥性。結(jié)腸癌細胞的細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核等作用及結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導致化療藥物的敏感性降低，從而產(chǎn)生耐藥性。常見的耐藥途徑如抗凋亡、藥物靶點或代謝酶改變、自噬及結(jié)腸癌細胞過度增殖等都是化療藥物產(chǎn)生抗藥性的主要機制。許多學者對多藥耐藥性的抑制劑進行了長久的探索，近年來中醫(yī)藥抗腫瘤作用的研究備受關(guān)注，尤其在逆轉(zhuǎn)化療耐藥方面?？鄥A是由豆科植物類提取的生物堿，具有抗腫瘤、抗肝纖維化、治療病毒性肝炎、心肌炎等作用，但在結(jié)腸癌自噬方面研究相對較少。本研究觀察苦參堿對結(jié)腸癌耐藥細胞的化療藥物敏感性及自噬水平的影響，旨在為臨床應用苦參堿干預腫瘤機理提供依據(jù)。

1.資料與方法

1.1實驗儀器 超凈工作臺、CO2恒溫培養(yǎng)箱、電熱干燥箱、高壓蒸汽消毒器、冰箱、液氮容器、濾器、真空泵、顯微鏡、天平、高速低溫離心機、恒溫水浴鍋、勻漿器、電泳儀、電泳槽、微波爐、平底燒瓶、凝膠成像儀等儀器。

1.2實驗方法

1.2.1CCK-8法檢測 取對數(shù)生長期的HCT-8/VCR、HCT-8細胞，按細胞傳代方法制備細胞懸液，并進行細胞計數(shù)，將2組細胞接種于96孔板，實驗組加入化療藥長春新堿及5-FU、阿霉素（ADM），空白對照及陰性組加等體積培養(yǎng)液。培養(yǎng)一段時問后觀察細胞株的耐藥情況。

1.2.2CCK-8法檢測苦參堿干預后HCT-8/VCR細胞藥敏性的變化 根據(jù)耐藥細胞株HCT-8/VCR的多藥耐藥性的實驗結(jié)果.制備HCT-8/VCR+Ma細胞。各取1瓶處于對數(shù)生長期的HCT-8/VCR及HCT-8/VCR+Ma細胞，每組分為實驗組、陰性對照組及空白對照組。以藥物濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標繪制濃度效應曲線.求回歸方程.得出50%抑制濃度（IC50）。計算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)：逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=耐藥細胞IC50/Ma作用后耐藥細胞IC50。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測苦參堿作用耐藥細胞后的細胞凋亡率 取對數(shù)生長期的HCT-8/VCR及HCT-8細胞，將2組細胞接種于6孔板，每組細胞分別設(shè)2個組：對照組、實驗組，實驗組中加入上述適宜濃度的Ma，對照組不經(jīng)任何處理。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，實驗組加人不同濃度的化療藥長春新堿.對照組中的耐藥組加入同濃度、等量長春新堿，對照組的親本細胞組不做任何處理作為陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出細胞用FCM法檢測細胞凋亡率。

1.2.4Western Blotting檢測自噬相關(guān)基因P62、Beclin-1、LC3蛋白表達 取處于生長期的HCT-8/VCR，分到2個培養(yǎng)瓶培養(yǎng)48 h，1瓶為實驗組，加人無毒性濃度的Ma.1瓶為陰性對照組.加人等量培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用RIPI細胞裂解液裂解細胞，收集蛋白質(zhì)樣品，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。之后對兩組細胞進行轉(zhuǎn)膜、SDS-PAGE電泳、封閉與雜交，最后曝光鑒定自噬相關(guān)基因的表達。

1.2.5MDC法檢測單用長春新堿或苦參堿或者兩者聯(lián)合應用后自噬囊泡的形成 按照實驗分組進行細胞培養(yǎng)，干預48 h后，用PBS洗2次，加適量0.05mmo]/L的MDC染液于37℃溫育1 h.4%多聚甲醛固定15 min.棄甲醛晾干后.熒光顯微鏡下觀察細胞自噬囊泡的形成情況，計數(shù)，拍照。

1.3評價指標 （1）在全自動酶標儀上于490 nm波長處測定光密度（optical density，OD）值，計算5個復孔平均OD值.計算Ma作用48 h后對HCT-8/VCR、HCT-8細胞的抑制率（inhibition rate，IR）。計算公式：IR（%）=[1-（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（陰性對照組OD值-空白對照組OD值）]×100%。不同濃度的抑制率分別為5個復孔細胞抑制率的平均值；（2）對照組和實驗組的細胞凋亡率分別為6個孔細胞凋亡率的平均值。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組方差齊性采用t檢驗，兩組方差不齊采用t檢驗。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA），兩兩比較采用q檢驗（Newman-Keuls法），檢驗水準：a=0.05，雙側(cè)檢驗。

2.結(jié)果

2.1苦參堿的不同濃度對HCT-8/VCR細胞增殖的抑制率 在苦參堿作用24 h和48 h后，苦參堿對HCT-8細胞增殖有抑制作用且其抑制作用會隨著苦參堿濃度的增加而增強。與濃度為0.5 mg/ml相比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。見表1。

2.2FCM檢測苦參堿作用后兩組細胞HCT-8/VCR的凋亡率比較 運用FCM方法對各組細胞的凋亡率進行檢測發(fā)現(xiàn).采用苦參堿的實驗組的細胞凋亡率大大高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），說明苦參堿可以誘導細胞的凋亡。見表2。

2.3Western Blotting檢測結(jié)果 在苦參堿應用24 h后，HCT-8/VCR細胞質(zhì)中出現(xiàn)了帶有細胞器的泡狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)確認為自噬泡。Western Blotting檢測顯示隨著苦參堿濃度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表達水平也隨之增強。

3.討論

近年來有關(guān)中醫(yī)藥治療肝癌的研究取得較大進展，成為臨床實驗研究熱點之一，中藥因其低毒、高效與多階段性作用的優(yōu)勢，已在腫瘤化療耐藥逆轉(zhuǎn)方法的研究中逐步受到重視?？鄥A（Matrine）是一種從我國傳統(tǒng)中藥苦參、廣豆根中提取的生物堿。前期研究表明苦參堿對結(jié)腸癌患者的恢復有促進作用.它可以使hTERT表達下調(diào).抑制結(jié)腸癌細胞增殖和端粒酶活性，誘導細胞凋亡。本研究運用苦參堿對結(jié)腸癌細胞HCT-8/VCR進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦參堿具有抗腫瘤的藥理活性，能抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、增殖、誘導其凋亡及向正常細胞分化。苦參堿作用24 h和48 h，HCT-8細胞增殖的抑制作用隨著苦參堿濃度的增加而增強.對HCT-8細胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性。運用FCM方法對各組細胞的凋亡率進行檢測發(fā)現(xiàn)，采用苦參堿的實驗組的細胞凋亡率大大高于對照組，說明苦參堿可以誘導細胞的凋亡，抑制結(jié)腸癌細胞增殖。在苦參堿應用24 h后，HCT-8/VCR細胞質(zhì)中出現(xiàn)了帶有細胞器的泡狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)確認為自噬泡?？鄥A是一類獨特的生物堿，具有抗肝纖維化、抗腫瘤、治療病毒性肝炎、心肌炎等作用，近年來其抗腫瘤作用的研究備受關(guān)注，尤其在逆轉(zhuǎn)化療耐藥方面。自噬在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用。自噬可以使結(jié)腸癌細胞的適應凋亡刺激、耐受侵襲性以及營養(yǎng)缺乏的能力提高，在某種程度下會引起結(jié)腸癌的發(fā)生。有研究證實：在早期和進展期結(jié)腸癌中關(guān)鍵蛋白LC3和Beclin-1表達升高，使結(jié)直腸癌核心部位細胞可以耐受營養(yǎng)缺乏和缺氧。誘導腫瘤細胞凋亡是化療藥物殺傷腫瘤細胞的主要途徑，是促進患者化療成功的重要因素。在大多數(shù)情況下，自噬與結(jié)腸癌細胞耐藥性密切相關(guān)，抑制自噬就可以增加結(jié)腸癌細胞對化療藥物的敏感性，提高患者的化療效果。以往實驗結(jié)果表明在LC3細胞形態(tài)學、染色等方面苦參堿能夠誘導結(jié)腸癌細胞發(fā)生自噬。我們用Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)隨著苦參堿濃度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表達水平也隨之增強，與上述文獻結(jié)果相一致。本研究對苦參堿在結(jié)腸癌自噬方面也進行了分析，為臨床應用苦參堿干預腫瘤機理提供依據(jù)，但此次研究仍存在樣本例數(shù)較少等諸多不足，有必要擴大樣本例數(shù)進一步觀察。

綜上所述，苦參堿能夠提高結(jié)腸癌耐藥細胞的自噬水平，逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐藥細胞HCT-8/VCR的多藥耐藥性，誘導細胞的凋亡，抑制細胞的增殖，為臨床應用苦參堿抗腫瘤提供理論依據(jù)。