趙守香　王濤　李玉軍

作者單位：266003青島市，青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科（趙守香　李玉軍）121013　錦州市，遼寧醫(yī)學(xué)院醫(yī)療學(xué)院（王濤）

?

miR－21靶向調(diào)控STAT3基因抑制人乳腺癌MCF－7細(xì)胞的侵襲

趙守香王濤李玉軍

作者單位：266003青島市，青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科（趙守香李玉軍）121013錦州市，遼寧醫(yī)學(xué)院醫(yī)療學(xué)院（王濤）

【摘要】目的探討miR－21和信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）基因在人乳腺癌MCF－7細(xì)胞中的表達，闡明miR－21對STAT3基因的靶向作用及其對MCF－7細(xì)胞侵襲的影響。方法購買并培養(yǎng)MCF－7細(xì)胞，采用免疫熒光法檢測STAT3在癌細(xì)胞中的表達。運用生物信息學(xué)方法對miR－21和STAT3基因的靶向配對關(guān)系進行預(yù)測，采用熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定；脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染miR－21模擬物后，qRT－PCR檢測miR－21和STAT3 mRNA在癌細(xì)胞中的表達，Western blot檢測STAT3蛋白在癌細(xì)胞中的表達，Transwell小室檢測MCF－7細(xì)胞體外的侵襲性。結(jié)果光鏡下可見人乳腺癌MCF－7細(xì)胞成片生長，有突起；細(xì)胞免疫熒光法檢測結(jié)果顯示胞質(zhì)內(nèi)有STAT3蛋白的表達，顯示紅色熒光。生物信息學(xué)軟件miRanda和TargetScan顯示miR－21和STAT3基因二者靶向配對良好，熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定發(fā)現(xiàn)miR－21 mimics能夠抑制STAT3 mRNA表達。qRTPCR和Western blot檢測結(jié)果表明過表達miR－21能夠降低STAT3 mRNA和蛋白的表達。Transwell小室實驗結(jié)果表明miR－21的過表達能夠抑制MCF－7細(xì)胞的侵襲。結(jié)論miR－21通過負(fù)性調(diào)控人乳腺癌MCF－7細(xì)胞中STAT3基因的表達，進而抑制癌細(xì)胞的侵襲。

【關(guān)鍵詞】微小RNA；信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3；乳腺癌MCF－7細(xì)胞；生物信息學(xué)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢并呈現(xiàn)年輕化特點，手術(shù)切除不僅對患者身體造成極大地創(chuàng)傷，也對女性患者造成極大地心理負(fù)擔(dān)。因此，探尋乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機制及其新的治療方法在當(dāng)前是迫切的。信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription3，STAT3）是一種與酪氨酸磷酸化信號通道偶聯(lián)的功能蛋白，主要存在于線粒體中［1，2］。最近研究［3，4］發(fā)現(xiàn)STAT3在乳腺癌組織中異常高表達，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼RNA，長度大約為21～25 nt，通過與靶基因mRNA 3＇端非翻譯區(qū)（3＇untranslated regions，3＇UTR）互補，降解目的基因并下調(diào)其表達［5］，以此參與疾病發(fā)生過程中基因表達的調(diào)控。

本文研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法對miR－21和STAT3基因的靶向配對關(guān)系進行預(yù)測，并采用熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定STAT3基因在乳腺癌細(xì)胞中的表達；脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染miR－21模擬物進入人乳腺癌MCF－7細(xì)胞后，qRT－PCR檢測miR－21和STAT3 mRNA在癌細(xì)胞中的表達，Western blot檢測STAT3蛋白在癌細(xì)胞中的表達，闡明miR－21對STAT3基因的靶向作用；Transwell小室檢測癌細(xì)胞體外的侵襲性，揭示miR－21對人乳腺癌MCF－7細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1　材料與方法

1.1主要儀器與試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibico公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD 18－T載體、DNA連接試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、RNAiso for small RNA和SYBR Premix Ex Taq II購自TaKaRa公司，pmirGLO質(zhì)粒和Dual－Luciferase報告系統(tǒng)購自Promega公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司，脂質(zhì)體2000購自Invitrogen公司，miR－21 mimics購自GenePharma公司，兔抗人STAT3抗體購自Santa Cruz公司，人乳腺癌MCF－7細(xì)胞購自上海生物細(xì)胞研究所。

1.2MCF－7細(xì)胞培養(yǎng)及免疫熒光檢測STAT3表達MCF－7細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，孵箱中（37℃、5%CO2）培養(yǎng)，每3 d換一次液，細(xì)胞貼壁達到80%左右，用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化并傳代。取適量細(xì)胞涂片，10%甲醛固定后，0.1%BSA封閉1 h，加兔抗人STAT3抗體，室溫孵育1 h，PBS沖洗3次，每次5 min，二抗加TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（1∶200），DAPI復(fù)染細(xì)胞核。

1.3生物信息學(xué)方法預(yù)測運用miRNA生物信息學(xué)軟件miRanda（http://www.microrna.org/）和TargetScan（http://www.targetscan.org/）對miR－21和STAT3基因的靶向配對關(guān)系進行預(yù)測。

1.4熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定提取MCF－7細(xì)胞的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，運用正向引物5＇－CCGAGCTCATTTGTCCACCAGCATTA－3＇和反向引物5＇－GCTCTAGAAGCCAGCCAGTATTTTA－3＇擴增STAT3 mRNA的3＇UTR。Sac I和Xba I雙酶切STAT3 3＇UTR以及pmirGLO質(zhì)粒，DNA連接試劑盒連接酶切片段，構(gòu)建熒光素酶報告載體（3＇UTR－pmirGLO），轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中擴增，質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染STAT3 3＇UTR－pmirGLO以及miR－21 mimics或?qū)φ誱iRNA，Dual－Luciferase報告系統(tǒng)檢測熒光強度。

1.5qRT－PCR檢測取轉(zhuǎn)染miR－21 mimics的MCF－7細(xì)胞以及空白對照組細(xì)胞，分別加入Trizol 或RNAiso for small RNA（TaKaRa）提取總mRNA或總miRNA，運用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋后加入SYBR Premix Ex Taq II（TaKaRa）和引物（表1），跑40個循環(huán)的PCR反應(yīng)，并對反應(yīng)結(jié)果進行定量分析。

表1　引物序列

1.6Western blot檢測取轉(zhuǎn)染miR－21 mimics的MCF－7細(xì)胞及對照組細(xì)胞，分別加入RIPA裂解液充分震蕩，超聲破碎，在4℃下以離心半徑8 cm，12000 r／min離心20 min，采用BCA法測定樣品總蛋白量。取15 μl樣品經(jīng)SDS－PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，用4%BSA封閉1 h，加入兔抗人STAT3抗體（1∶200），4℃過夜后，滴加二抗（1∶800），4℃搖床1 h后凝膠成像系統(tǒng)ECL發(fā)光顯影，以β－actin作為內(nèi)參。

1.7Transwell小室檢測MCF－7細(xì)胞體外侵襲將轉(zhuǎn)染miR－21 mimics的MCF－7細(xì)胞以及空白對照組細(xì)胞加入無血清培養(yǎng)基并置入Transwell上室中，下室加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，24 h后，取出小室，用甲醇固定小室反面細(xì)胞20 min，于結(jié)晶紫染液中染色15 min。光鏡下取3個隨機視野計算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，兩組間計量資料的比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MCF－7細(xì)胞培養(yǎng)及免疫熒光法檢測STAT3表達光鏡下可見人乳腺癌MCF－7細(xì)胞成片生長，有突起，見圖1A；細(xì)胞免疫熒光法檢測結(jié)果顯示胞質(zhì)內(nèi)有STAT3蛋白的表達，呈紅色熒光，見圖1B～D。

圖1　MCF－7細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

2.2miR－21和STAT3基因靶向配對關(guān)系分別運用TargetScan和miRanda生物信息學(xué)軟件對miR－21和STAT3（NM＿003150）基因的靶向配對關(guān)系進行預(yù)測，TargetScan顯示miR－21在STAT3 mRNA 3＇UTR上有一個保守的靶位點，其類型為7mer－m8，匹配得分為95。miRanda結(jié)果表明miR－21與靶位點的mirSVR得分為－0.7660，綜合兩個生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果可以看出miR－21與STAT3基因配對良好，見表2。

2.3熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定結(jié)果熒光素酶報告系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，將對照組STAT3 3＇UTR－pmirGLO熒光素酶的表達量設(shè)為100%，則miR－21 mimics能使STAT3 3＇UTR－pmirGLO的熒光素酶表達量下降為（46.98±6.01）%，二者經(jīng)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝2.732，P＜0.05），見圖2。

2.4qRT－PCR檢測miR－21和STAT3 mRNA的表達結(jié)果將對照組miR－21的表達量設(shè)為100%，則轉(zhuǎn)染組的相對表達量是（21.08±7.48）%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝3.286，P＜0.05），見圖3a。將對照組STAT3 mRNA的表達量設(shè)為100%，轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)STAT3 mRNA的表達量下降至（49.97±8.62）%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝2.461，P＜0.05），見圖3b。

圖2　熒光素酶相對活性

圖3　轉(zhuǎn)染后miR－21和STAT3 mRNA的相對表達

2.5Western blot檢測STAT3蛋白的表達水平Western blot檢測結(jié)果顯示，miR－21 mimics組STAT3蛋白相對表達量（0.46±0.11）較對照組（0.83± 0.17）明顯降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝2.269，P＜0.05），見圖4。表明過表達miR－21能夠降低STAT3蛋白的表達，結(jié)合熒光素酶報告系統(tǒng)以及qRT－PCR檢測結(jié)果，表明miR－21能夠靶向作用STAT3 3＇UTR負(fù)性調(diào)控STAT3基因表達。

2.6Transwell小室檢測miR－21抑制MCF－7細(xì)胞的侵襲結(jié)果Transwell小室檢測MCF－7細(xì)胞的體外侵襲能力，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組（mimics）的穿膜細(xì)胞數(shù)（19.27±6.54）較空白對照組（85.46±10.35）明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝4.095，P＜0.05），見圖5。

3　討論

表2　miR－21與STAT3基因靶向配對關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)在非哺乳期STAT3能夠促進乳腺的退化［6］，但在癌癥中STAT3的激活具有致瘤性［7］。STAT3基因定位于人類第12號染色體上，生理狀態(tài)下STAT3蛋白的激活是快速而短暫的，有利于維持細(xì)胞正常的生理功能，而持續(xù)性的激活可參與誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化以及凋亡，其下游基因伴隨異常高表達，致使癌癥產(chǎn)生，該途徑在乳腺癌中尤為突出［8－10］。大約70%的乳腺癌中都有STAT3的激活，并且發(fā)生在各級乳腺癌尤其是缺乏雌激素受體或孕激素受體表達的三陰性乳腺癌［11］。在乳腺癌中，STAT3主要由白介素－6（interleukin，IL－6）所激活，許多乳腺癌細(xì)胞系能夠產(chǎn)生IL－6，其通過IL－6受體和JAK激酶信號通路以自分泌的方式激活STAT3，進而上調(diào)增殖、侵襲和凋亡抑制基因的表達，促進癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，改變細(xì)胞的形態(tài)以及運動潛能，對癌細(xì)胞的生物學(xué)行為有重要影響［12－14］。此外，除了通過酪氨酸磷酸化激活STAT3之外，STAT3也能夠通過羧基末端的絲氨酸殘基被磷酸化而激活，大約60%乳腺癌STAT3的激活都是絲氨酸磷酸化，并與雌激素受體陰性的腫瘤相關(guān)聯(lián)。最近有研究［15］發(fā)現(xiàn)絲氨酸磷酸化的STAT3可在癌細(xì)胞的線粒體中找到，通過對線粒體功能的影響促進癌細(xì)胞的存活。

圖4　轉(zhuǎn)染后STAT3蛋白的表達

圖5　Transwell檢測MCF－7細(xì)胞的侵襲力

本文研究發(fā)現(xiàn)，光鏡下可見人乳腺癌MCF－7細(xì)胞成片生長，有突起；細(xì)胞免疫熒光檢查結(jié)果顯示，胞質(zhì)內(nèi)有STAT3蛋白的表達，顯示紅色熒光；qRTPCR和Western blot檢測結(jié)果均表明，乳腺癌MCF－7細(xì)胞內(nèi)有STAT3 mRNA和蛋白的高表達，提示STAT3基因與乳腺癌關(guān)系密切，或可作為其臨床診斷指標(biāo)之一。

miRNA已被證實與乳腺癌密切相關(guān)，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［16］。Wang等［17］研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中miR－204能夠靶向調(diào)控JAK2基因的表達，并能夠通過STAT3／BCl－2／survivin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。本文研究運用生物信息學(xué)方法對miR－21和STAT3基因的靶向配對關(guān)系進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)二者配對關(guān)系良好，采用熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定發(fā)現(xiàn)miR－21能夠抑制STAT3 mRNA表達；脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染miR－21 mimics后，qRT－PCR和Western blot檢測結(jié)果均表明，過表達miR－21能夠降低STAT3 mRNA和蛋白的表達。Transwell小室檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達miR－21能夠抑制MCF－7細(xì)胞的侵襲能力，提示miR－21通過靶向作用于STAT3基因能夠抑制乳腺癌MCF－7細(xì)胞的侵襲。由此可以得出，miR－21通過負(fù)性調(diào)控人乳腺癌MCF－7細(xì)胞中STAT3基因的表達，進而抑制癌細(xì)胞的侵襲。上述研究結(jié)果與Dong等［18］的研究中miR－21能夠促進癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的結(jié)論相反，可能與實驗對象、條件、環(huán)境、操作者等因素都會對結(jié)果產(chǎn)生一定影響有關(guān)，具體原因有待進一步研究。

綜上所述，miR－21能夠通過負(fù)性調(diào)控人乳腺癌MCF－7細(xì)胞中STAT3基因的表達，進而抑制癌細(xì)胞的侵襲。本文研究為深入探討乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制及其新的治療途徑奠定了一定的基礎(chǔ)。

4　參考文獻

1Nie XH，Ou－Yang J，Xing Y，et al.Paeoniflorin inhibits human glioma cells via STAT3 degradation by the ubiquitin－proteasome pathway.Drug Des Devel Ther，2015，9：5611－5622.

2Hayashi S，F(xiàn)ujishiro T，Hashimoto S，et al.p21 deficiency is susceptible to osteoarthritis through STAT3 phosphorylation.Arthritis Res Ther，2015，17：314.

3Sapio L，Sorvillo L，Illiano M，et al.Inorganic phosphate prevents erk1／2 and Stat3 activation and improves sensitivity to doxorubicin of MDA－MB－231 breast cancer cells.Molecules，2015，20：15910－15928.

4Wei G，Mingliang Z，Yong C，et al.Expression of signal transducer and activator of transcription 3 in breast cancer and its clinical significance.J Cancer Res Ther，2015，11：c56－c58.

5Chua JH，Armugam A，Jeyaseelan K.MicroRNAs：biogenesis，function and applications.Curr Opin Mol Ther，2009，11：189－199.

6Humphreys RC，Bierie B，Zhao L，et al.Deletion of Stat3 blocks mammary gland involution and extends functional competence of the secretory epithelium in the absence of lactogenic stimuli.Endocrinology，2002，143：3641－3650.

7Burke WM，Jin X，Lin HJ，et al.Inhibition of constitutively active Stat3 suppresses growth of human ovarian and breast cancer cells.Oncogene，2001，20：7925－7934.

8Zhang F，Wang Z，Yuan J，et al.RNAi－mediated silencing of Anxa2 inhibits breast cancer cell proliferation by downregulating cyclin D1 in STAT3－dependent pathway.Breast Cancer Res Treat，2015，153：263－275.

9Sonnenblick A，Brohée S，F(xiàn)umagalli D，et al.Constitutive phosphorylated STAT3－associated gene signature is predictive for trastuzumab resistance in primary HER2－positive breast cancer.BMC Med，2015，13：177.

10Rodriguez－Barrueco R，Yu J，Saucedo－Cuevas LP，et al.Inhibition of the autocrine IL－6－JAK2－STAT3－calprotectin axis as targeted therapy for HR－／HER2＋breast cancers.Genes Dev，2015，29：1631－1648.

11Marotta LL，Almendro V，Marusyk A，et al.The JAK2／STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44＋CD24－stem cell－like breast cancer cells in human tumors.J ClinInvest，2011，121：2723－2735.

12Sullivan NJ，Sasser AK，Axel AE，et al.Interleukin－6 induces an epithelial－mesenchymal transition phenotype in human breast cancer cells.Oncogene，2009，28：2940－2947.

13Yadav A，Kumar B，Datta J，et al.IL－6 promotes head and neck tumor metastasis by inducing epithelial－mesenchymal transition via the JAK－STAT3－SNAIL signaling pathway.Mol Cancer Res，2011，9：1658－1667.

14Walker SR，Chaudhury M，Nelson EA，et al.Microtubule－targeted chemotherapeutic agents inhibit signal transducer and activator of transcription 3（STAT3）signaling.Mol Pharmacol，2010，78：903－908.

15Gough DJ，Corlett A，Schlessinger K，et al.Mitochondrial STAT3 supports Ras－dependent oncogenic transformation.Science，2009，324：1713－1716.

16Deng X，Zhao Y，Wang B.miR－519d－mediated downregulation of STAT3 suppresses breast cancer progression.Oncol Rep，2015，34：2188－2194.

17Wang X，Qiu W，Zhang G，et al.MicroRNA－204 targets JAK2 in breast cancer and induces cell apoptosis through the STAT3／BCl－2／survivin pathway.Int J Clin Exp Pathol，2015，8：5017－5025.

18Dong G，Liang X，Wang D，et al.High expression of miR－21 in triple－negative breast cancers was correlated with a poor prognosis and promoted tumor cell in vitro proliferation.Med Oncol，2014，31：57.

（本文編輯：陳淑蓮）

消息

The role of miR－21 in human breast cancer MCF－7 cells invasion by regulating STAT3 expression

ZHAO Shou－xiang1，WANG Tao2，LI Yu－jun1.1Department of Pathology，the Affiliated Hospital，Qingdao University，Qingdao 266003，China2Medical Treatment College，Liaoning Medical University，Jinzhou 121013，China

【Abstract】Objective To identify expressions of miR－21 and signal transducer and activator of transcription 3（STAT3）in human breast cancer MCF－7 cells and explore the role of miR－21 on cell invasion which regulate expression of STAT3.Methods MCF－7 cells were cultured in vitro.Cell morphology was observed by phase contrast microscope and the expression of STAT3 in MCF－7 cells was determined by immunofluorescence cytochemistry method.MiR－21 which regulated expression of STAT3 was predicted by bioinformatics and identified with luciferase assay.After transfection of miR－21 mimics into cells，the expressions of miR－21 and STAT3 were determined by qRT－PCR and Western blot.The invasion of MCF－7 cells was detected in vitro by transwell chamber.Results The MCF－7 cell grew flakily with prominency under light microscope.Expression of STAT3 was positive by immunofluorescence cytochemistry.MiRanda and TargetScan showed that miR－21 was well complementary with STAT3 gene.MiR－21 mimics could inhibit STAT3 mRNA expression showed by luciferase assay.Results of qRT－PCR and Western blot showed that over－expression of miR－21 down－regulated expression of STAT3 mRNA and protein.The invasion of MCF－7 cells was suppressed after transfection of miR－21 mimics.Conclusion MiR－21 may negatively regulate STAT3 expression in human breast cancer MCF－7 cells and inhibit cells invasion.

【Key words】miRNA；Signal transducer and activator of transcription 3；Breast cancer MCF－7 cells；Bioinformatics

收稿日期：（2016－01－23）

doi：10.3969／j.issn.1674－7151.2016.01.002

通訊作者：李玉軍，E－mail：liyujun.66@163.com