曹宗喜，焦培榮，林哲敏，亓文寶，張桂紅*（.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？凇?700；.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州　5064）

?

豬繁殖與呼吸綜合征病毒CD163受體功能域鑒定

曹宗喜1,2，焦培榮2，林哲敏1，亓文寶2，張桂紅2*
（1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?71100；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642）

摘要：豬繁殖與呼吸綜合征是危害養(yǎng)豬業(yè)重要傳染病之一，CD163是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染易感細(xì)胞受體。研究表明CD163受體的前2個(gè)SRCR區(qū)域與PRRSV感染無關(guān)。為確定PRRSV感染細(xì)胞過程中CD163受體關(guān)鍵SRCR區(qū)域，構(gòu)建表達(dá)野生型CD163受體和缺失不同個(gè)數(shù)SRCR區(qū)域的CD163受體突變體質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞24 h后，XH-GD株P(guān)RRSV感染細(xì)胞，進(jìn)行間接免疫熒光（IFA）觀察。結(jié)果顯示，CD163前4個(gè)SRCR重復(fù)區(qū)缺失不影響PRRSV感染，SRCR5是PRRSV感染細(xì)胞所必須。為進(jìn)一步研究CD163受體在PRRSV感染Marc-145細(xì)胞過程中的作用及與其他受體之間相互關(guān)系提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；Marc-145細(xì)胞；CD163；功能域；鑒定

曹宗喜,焦培榮,林哲敏,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒CD163受體功能域鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(3):23-30.

Cao Zongxi,Jiao Peirong,Lin Zhemin,et al.Identification of the CD163 receptor domains related to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(3):23-30.(in Chinese with English abstract)

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome Virus，PRRSV）感染所致的急性傳染病。該病以妊娠母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙、各年齡階段豬呼吸道癥狀、哺乳仔豬高死亡率、免疫抑制和持續(xù)性感染等為主要特征[1]，高致病性PRRSV 2006年在我國首次出現(xiàn)[2-3]，其致病能力顯著增強(qiáng)。

PRRSV通過結(jié)合細(xì)胞受體感染易感細(xì)胞，CD163是豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染易感細(xì)胞受體之一。Calvert等研究表明前2個(gè)SRCR區(qū)缺失對CD163受體的功能無影響[4]。Van Gorp等利用CD163-L1（與CD163同屬于清道夫受體超家族B群，且與CD163結(jié)構(gòu)相似，但在PRRSV病毒復(fù)制過程中不發(fā)揮受體作用）相關(guān)區(qū)域?qū)D163嵌合突變發(fā)現(xiàn)，SRCR5是CD163與PRRSV相互作用關(guān)鍵功能域[5]。馮亞瓊等通過特異性抗體封閉PAM細(xì)胞上清道夫受體CD163不同的結(jié)構(gòu)域，用PRRSV處理已封閉的PAM細(xì)胞，CD163的SRCR5-6區(qū)在PRRSV或感染性免疫復(fù)合物感染宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮作用[6-7]。本研究以Marc-145細(xì)胞的CD163基因?yàn)檠芯繉ο?，通過構(gòu)建缺失不同SRCR區(qū)的CD163表達(dá)質(zhì)粒，確定CD163有效功能域，為進(jìn)一步闡明病毒吸附與內(nèi)化機(jī)制及受體蛋白與病毒結(jié)合的功能表位，CD163受體與其他受體的協(xié)同作用，全方位揭示PRRSV的分子致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

pcDNA3.1-Myc-His、TRIzol Reagent和Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix購自TOYOBO公司；T4DNA連接酶購自NEB公司；E.Z.N.A.Endo- Free Plasmid Mini Kit I購自O(shè)MEGA公司；HindⅢ和XhoⅠ、DNase I（RNase-free）和Reverse Transcriptase M-MLV （RNase H-）購自TaKaRa公司；Anti-His Antibody購自天根生化科技（北京）有限公司；Anti-Pig IgG （whole molecule）-FITC antibody produced in rabbit購自Sigma公司。

1.2引物設(shè)計(jì)

參照CD163受體基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增CD163的胞外區(qū)部分基因（見圖1），引物序列見表1。為便于基因的克隆及構(gòu)建表達(dá)載體等，在上、下游引物5'端分別加入HindⅢ和XhoⅠ位點(diǎn)（引物序列中劃線部分），由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

圖1　CD163受體及其功能域缺失構(gòu)建模式Fig.1 CD163 deletion constructs were used to identify which SRCRs in CD163 are involved in function

表1　CD163受體及其功能域缺失構(gòu)建的引物Table 1 Primers used to amplify the full-length CD163 or CD163 deletion constructs

1.3真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

以前期研究[8]得到的重組質(zhì)粒pMD20-CD163為模板，用引物M163-Dx（x=0～8）和M163-DR對CD163受體或其不同SRCR區(qū)域缺失CD163受體PCR擴(kuò)增，并設(shè)空白對照。PCR擴(kuò)增條件：94℃2 min，1個(gè)循環(huán)；94℃30 s，55℃30 s，68℃3 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收。再將載體pcDNA3.1-Myc-His和PCR回收產(chǎn)物均用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切，連接電泳回收產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α。經(jīng)質(zhì)粒抽提、酶切鑒定正確后送Invitrogen公司測序，測序重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-Dx CD163。

1.4真核表達(dá)質(zhì)粒mRNA水平上的表達(dá)鑒定

以得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Dx CD163轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，采用lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。取轉(zhuǎn)染后48 h BHK-21細(xì)胞，參照Invitrogen公司TRIzol Reagent使用說明書提取總RNA。檢測合格的RNA 經(jīng)DNase I（RNase-free）消化后反轉(zhuǎn)錄，再以M163-D0和M163-DR為引物進(jìn)行RT-PCR，從mRNA水平檢測各真核表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)情況。

1.5真核表達(dá)質(zhì)粒蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)鑒定

以得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1- Dx CD163轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，取轉(zhuǎn)染后48 h BHK-21細(xì)胞，Anti-His Antibody為一抗，參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行IFA，檢測重組表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)情況。

1.6 CD163功能域的初步篩選

以1.3得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Dx CD163轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，取轉(zhuǎn)染后48 h BHK-21細(xì)胞，用PRRSV陽性血清為一抗，參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行IFA，根據(jù)病毒感染情況初步篩選CD163受體的有效功能域。

BHK-21細(xì)胞轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-D0 CD163或pcDNA3.1-D4 CD163 24 h后，棄上清，PBS洗細(xì)胞3次；加入104TCID50的PRRSV XHGD株37℃吸附1 h；棄病毒液，PBS洗細(xì)胞3次，加入含2%血清的DMEM，37℃分別培養(yǎng)1、6、12、24和48 h后，收獲細(xì)胞。凍融3次后，7 000 r·min-1室溫離心7 min，取上清，對其進(jìn)行TCID50測定。

2　結(jié)果與分析

2.1 CD163基因片段擴(kuò)增和克隆

以重組質(zhì)粒pMD20-T-CD163為模板，用引物M163-Dx（x=0～8）和M163-DR對CD163受體或其不同SRCR區(qū)域缺失CD163受體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各擴(kuò)增產(chǎn)物分別標(biāo)記為Dx CD163（x=0～8）。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見相應(yīng)目的條帶，Dx CD163（x=0～ 8）基因擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別約為3.4、3.0、2.7、2.3、2.0、1.7、1.3、1.0或0.7 kb，與預(yù)期長度相符（見圖2）。

2.2質(zhì)粒pcDNA3.1-Dx酶切鑒定

用T4DNA連接酶對載體pcDNA3.1-Myc-His和PCR回收產(chǎn)物的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α。滅菌牙簽挑取可疑菌落于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)16 h，質(zhì)粒提取，并酶切鑒定。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Dx CD163（x=0～8）經(jīng)HindⅢ和XhoⅠ雙酶切獲得分別約為5.4 kb片段（載體pcDNA3.1-Myc-His的雙酶切條帶）和3.4、3.0、2.6、2.3、2.0、1.7、1.3、1.0或0.6 kb片段（Dx CD163（x=0～ 8）的雙酶切條帶），與預(yù)期相符（見圖3）。酶切鑒定為陽性的菌液于上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司序列測定，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-Dx CD163（x=0～8）。

2.3真核表達(dá)質(zhì)粒mRNA水平上的表達(dá)鑒定

將得到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Dx CD163（x= 0～8）轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h的BHK-21細(xì)胞，經(jīng)總RNA提取，測濃度并取1 μg的RNA電泳檢測，結(jié)果顯示RNA呈現(xiàn)出3條rRNA帶，分別是28S、18S和5S rRNA帶；28S亮度約是18S亮度的2倍，可進(jìn)行下游試驗(yàn)（見圖4a）。

圖2　Dx CD163PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of Dx CD163

為避免DNA對下游試驗(yàn)產(chǎn)生影響，經(jīng)檢測合格的RNA取5 μg進(jìn)行DNase I（RNase-free）消化，得到的RNA再次進(jìn)行濃度測定和電泳檢測，電泳顯示經(jīng)DNase I（RNase-free）消化的RNA檢測合格，可用于下游試驗(yàn)（見圖4b）。

得到的RNA經(jīng)RT-PCR后，電泳觀察可見相應(yīng)目的條帶，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Dx CD163（x=0～8）質(zhì)粒的細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增條帶分別約為3.4、3.0、2.7、2.3、2.0、1.7、1.3、1.0或0.7 kb，與預(yù)期相符（見圖4c）。

2.4真核表達(dá)質(zhì)粒蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)鑒定

取轉(zhuǎn)染48 h的BHK-21細(xì)胞，進(jìn)行IFA分析，熒光顯微鏡下觀察，野生型CD163受體和各SRCR區(qū)域突變的CD163受體質(zhì)粒在BHK-21細(xì)胞上均可正常表達(dá)（見圖5）。

2.5 CD163功能域初步篩選

BHK-21細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h且感染PRRSV 24 h后，進(jìn)行IFA分析，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Dx CD163（x=0～4）的BHK-21細(xì)胞檢測到病毒，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Dx CD163（x=5～8）的BHK-21細(xì)胞卻未檢測到病毒（見圖6），根據(jù)病毒感染情況初步證明CD163受體的前4個(gè)SRCR區(qū)域缺失不影響PRRSV感染。

圖3　pcDNA3.1-Dx CD163酶切鑒定圖Fig.3 Restricted enzymes digestion of pcDNA3.1-Dx CD163

圖4　真核表達(dá)質(zhì)粒mRNA水平上的表達(dá)鑒定Fig.4 RT-PCR results showing the mRNAs from BHK-21 cell transfected with pcDNA3.1-Dx CD163(x=0～8)

圖5　不同突變體CD163真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后IFA鑒定（×100）Fig.5 IFA analysis of BHK-21 cells were transfected with pcDNA3.1-Dx CD163(x=0～8)(×100)

圖6　CD163作用域的初步篩選（×100）Fig.6 IFA analysis to identify which SRCRs in CD163 are involved in function(×100)

BHK-21細(xì)胞轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-D0 CD163或pcDNA3.1-D4 CD163，分別感染PRRSV 1、6、12、24和48 h后，收獲細(xì)胞，進(jìn)行TCID50測定。從圖7可知，在病毒感染BHK-21細(xì)胞（表達(dá)缺失前4個(gè)SRCR區(qū)域的突變型CD163受體或野生型的CD163受體）后不同時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)病毒量差異不顯著；病毒感染細(xì)胞后12 h內(nèi)，野生型CD163受體更有利于病毒的增殖，而12 h后，缺失前4個(gè)SRCR區(qū)域的突變型CD163受體較野生型CD163受體有利于病毒增殖。

圖7　野生型CD163受體D0 CD163和突變型CD163受體D4 CD163比較Fig.7 Kinetics of PRRSV infection in BHK cells CD163 expressing or D4 CD163

3　討論與結(jié)論

PRRSV通過結(jié)合細(xì)胞受體感染易感細(xì)胞，CD163是PRRSV感染細(xì)胞受體之一[4]。對豬CD163基因克隆、序列分析、原核部分表達(dá)和真核表達(dá)等展開研究[14-19]，該CD163基因源于豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）；Marc-145細(xì)胞與PAM細(xì)胞相比無Sn，而CD163和Sn在PRRSV感染過程中具有協(xié)同作用[20]。因此，本研究以Marc-145細(xì)胞CD163受體為對象，分析其在PRRSV感染Marc-145細(xì)胞過程中作用，可避開Sn影響。

Calvert等發(fā)現(xiàn)前2個(gè)SRCR區(qū)缺失對CD163受體功能無影響[4]。因此假設(shè)前X（X≥2）個(gè)SRCR區(qū)域缺失不影響CD163作為PRRSV感染細(xì)胞的受體功能。構(gòu)建一系列真核表達(dá)質(zhì)粒，分別表達(dá)不同個(gè)數(shù)的SRCR區(qū)缺失CD163受體突變體，再將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染非允許細(xì)胞BHK細(xì)胞，經(jīng)PRRSV感染后，IFA檢測病毒感染情況。由結(jié)果可知，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Dx CD163（x=0～4）的BHK細(xì)胞中檢測出病毒，說明前4個(gè)SRCR區(qū)域缺失不影響PRRSV進(jìn)入細(xì)胞。

通過比較野生型和突變型豬CD163受體，發(fā)現(xiàn)在缺失SRCR區(qū)域前有14個(gè)氨基酸相同。這段序列可能與CD163受體的轉(zhuǎn)錄或蛋白翻譯后的加工修飾有關(guān)。因此，在構(gòu)建各SRCR區(qū)域缺失的CD163受體突變體時(shí)，在每個(gè)質(zhì)粒的SRCR重復(fù)區(qū)前加14個(gè)氨基酸序列。

為進(jìn)一步解CD163受體和D4 CD163受體差別及其對病毒生長影響，將轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1- D0 CD163或pcDNA3.1- D4 CD163的BHK細(xì)胞分別感染PRRSV 1、6、12、24和48 h后，收獲細(xì)胞，由TCID50結(jié)果可知，缺失前4個(gè)SRCR區(qū)域的突變型CD163受體和野生型的CD163受體相比，對PRRSV感染細(xì)胞及病毒生長無明顯影響。說明SRCR5對CD163受體PRRSV的感染具有重要作用，與Van Gorp研究結(jié)果一致[5]。

Van Gorp等和馮亞瓊等分別通過SRCR區(qū)嵌合突變和抗體阻斷方法研究CD163的關(guān)鍵功能域[5-7]。本試驗(yàn)通過SRCR區(qū)逐一缺失的方法研究Marc-145細(xì)胞的CD163受體功能域，通過抗體阻斷方法進(jìn)一步驗(yàn)證。Marc-145細(xì)胞CD163受體在PRRSV機(jī)制中作用尚待深入研究。

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Identification of the CD163 receptor domains related to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection

CAO Zongxi1,2,JIAO Peirong2,LIN Zhemin1,QI Wenbao2,ZHANG Guihong2(1.Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Animal Reproduction and Breeding and Veterinary Medicine,Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Hainan Academy of Agricultural Sciences,Haikou 571100,China; 2.MOA Key laboratory for Animal Vaccine Development,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

Abstract:Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)had been acknowledged as one of the most important agents affecting swine industry.The scavenger receptor CD163 was one of the important entry mediators for PRRSV infection.To identify which SRCRs in CD163 were involved in this function,CD163 or Dx CD163 deletion mutants were cloned to eukaryotic expression vector pcDNA3.1-Myc-His,then the pcDNA3.1-Dx CD163(x=0-8)plasmid were transfected into BHK-21 cells using Lipofectamine 2000.The plasmid transfected cells at 24 h post-transfection were infected with XHGD strain of PRRSV.After 1 h adsorption period,inocula were removed and cells were washed with PBS.After an additional incubation for 24 h at 37℃,cell monolayers were observed and analysed by IFA.The result showed that the first four SRCR repeats of CD163 were not required for PRRSVbook=24,ebook=29receptor activity,and SRCR5 was essential for PRRSV infection.The results lay foundation for analyzing the function of CD163 as PRRSV receptor in cultured cell.

Key words:PRRSV; Marc-145 cell; CD163; domains; identification

*通訊作者：張桂紅，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楂F醫(yī)傳染病學(xué)。E-mail:guihongzh@scau.edu.cn

作者簡介：曹宗喜（1982-），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)傳染病學(xué)。E-mail:caozongxi@163.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272564）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金項(xiàng)目（CARS- 36）；海南省科學(xué)事業(yè)費(fèi)項(xiàng)目（13-214002- 0002）

收稿日期：2016-01-19

中圖分類號：S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1005-9369（2016）03-0023-08