許修宏，王婷婷，孟慶欣，孫雪微，成利軍，張文浩，孫　瑜，任廣明，朱麗平，王紫琪，賀　寧（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱　150030）

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牛糞堆肥中厭氧氨氧化菌分子生物學(xué)檢測(cè)

許修宏，王婷婷，孟慶欣，孫雪微，成利軍，張文浩，孫瑜，任廣明，朱麗平，王紫琪，賀寧
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150030）

摘要：研究利用PCR-DGGE方法對(duì)堆肥中厭氧氨氧化菌16S rRNA基因特異擴(kuò)增，檢測(cè)堆肥厭氧氨氧化菌種屬及多樣性水平。結(jié)果表明，牛糞堆肥中厭氧氨氧化菌群組成與海洋環(huán)境不同。海洋環(huán)境中Candidatus Scalindua屬厭氧氨氧化菌為優(yōu)勢(shì)菌群，而牛糞堆肥中厭氧氨氧化菌中優(yōu)勢(shì)菌屬為Candidatus Brocadia、Candidatus Kuenenia和Candidatus Scalindua，多樣性相對(duì)較高。可為堆肥發(fā)酵過(guò)程中厭氧氨氧化過(guò)程提供分子生物學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：厭氧氨氧化菌；堆肥；PCR-DGGE

許修宏,王婷婷,孟慶欣,等.牛糞堆肥中厭氧氨氧化菌分子生物學(xué)檢測(cè)[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(3):52-58.

Xu Xiuhong,Wang Tingting,Meng Qingxin,et al.Molecular detection of anaerobic ammonium oxidation bacteria in cow manure composting[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(3):52-58.(in Chinese with English abstract)

厭氧氨氧化反應(yīng)（Anammox）以亞硝酸為電子受體，銨氮為電子供體，缺氧條件下產(chǎn)生氮?dú)猓堑匮h(huán)過(guò)程重要環(huán)節(jié)[1]。在反硝化工廠脫氮反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化反應(yīng)[2]，在自然界中也發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化反應(yīng)[3]，并從黑海首次鑒定出厭氧氨氧化菌[4]。缺氧的海洋沉積物和水柱、淡水沉積物、陸地生態(tài)系統(tǒng)和一些特殊生態(tài)系統(tǒng)等自然環(huán)境中均有厭氧氨氧化菌存在[5]。Kuenen認(rèn)為在海洋氮素循環(huán)中厭氧氨氧化菌貢獻(xiàn)率達(dá)50%以上[6]。不同區(qū)域環(huán)境中，厭氧氨氧化菌對(duì)氮素?fù)p失貢獻(xiàn)率在3%～ 41%之間，差異較大[7-9]。

厭氧氨氧化菌是厭氧菌，屬浮霉菌門（Plancto-mycetes），目前分為5個(gè)屬:Candidatus Brocadia[10]；Candidatus Kuenenia[11]；Candidatus Scalindua[12]；Candidatus Anammoxoglobus[13]和Candidatus Jettenia[14]，其中，Candidatus Scalindua主要分布在河口及海洋等水體環(huán)境中[15]，其他四種主要分布在農(nóng)田、濕地、水底沉積物和淡水河口等環(huán)境[16-19]，Candidatus Brocadia和Candidatus Kuenenia是厭氧氨氧化菌中最常見(jiàn)的兩個(gè)菌屬。堆肥系統(tǒng)氮素循環(huán)中也存在厭氧氨氧化反應(yīng)，但有關(guān)厭氧氨氧化菌分布及種群多樣性研究鮮有報(bào)道。

堆肥是國(guó)內(nèi)外對(duì)畜禽糞便無(wú)害化、資源化處理的主流技術(shù)。畜禽糞便經(jīng)快速堆腐和無(wú)害化處理后生成優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥料，施入農(nóng)田系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)廢棄物農(nóng)業(yè)循環(huán)再利用。氮素循環(huán)是堆肥過(guò)程關(guān)鍵步驟，氮素轉(zhuǎn)化與堆肥產(chǎn)品腐熟度和氮素?fù)p失率密切相關(guān)，直接影響堆肥質(zhì)量。因此，控制堆肥過(guò)程厭氧氨氧化反應(yīng)造成的氮素?fù)]發(fā)，提高堆肥質(zhì)量是堆肥研究關(guān)注問(wèn)題之一。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為堆肥中的氮素?fù)]發(fā)途徑主要是氨化作用和反硝化作用[20]，厭氧氨氧化作用為堆肥氮素轉(zhuǎn)化機(jī)理提供新理論依據(jù)。本研究利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)厭氧氨氧化菌16S rRNA基因擴(kuò)增，證明堆肥中厭氧氨氧化菌存在，通過(guò)序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析研究其多樣性，為研究堆肥發(fā)酵過(guò)程中不同種屬厭氧氨氧化菌消長(zhǎng)規(guī)律，明確堆肥氮素循環(huán)過(guò)程厭氧氨氧化反應(yīng)作用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1堆肥材料制備

本研究所用牛糞取自哈爾濱市幸福鄉(xiāng)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，稻草秸稈來(lái)自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地。堆肥混合物稻草秸稈截長(zhǎng)度為5 cm，牛糞和稻草秸稈干重比例5?1，含水率約65%，C/N為30?1。將堆肥混合物在自制發(fā)酵罐（50 cm×50 cm×110 cm）中發(fā)酵處理，期間每隔30 min通風(fēng)1次，每天測(cè)量3次溫度，且按溫度變化翻堆。

1.2樣品采集

本研究發(fā)酵周期為30 d，分別在第0、1、3、7、13、23、29天取樣。每次取樣分別從上、中、下三層等量取樣混合約500 g，保存溫度-20℃，用于DNA提取。

1.3 DNA提取與純化

分別取3～5 g堆肥樣品用于DNA提取，提取方法參照Liu等方法[21]。提取DNA作瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，試劑盒（Omega Bio-Tek，Inc.，Georgia，USA）純化回收，具體操作參照說(shuō)明書。

1.4 PCR與變性梯度凝膠電泳（DGGE）

以純化DNA為模板，運(yùn)用浮霉菌門通用引物Pla46f與細(xì)菌通用引物630r組合對(duì)細(xì)菌16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物為模板，用來(lái)自厭氧氨氧化菌特異引物組合Amx368f（GC）/ Amx820r對(duì)Candidatus Brocadia和Candidatus Kuenenia菌屬16S rRNA擴(kuò)增，引物組合Pla46f/Amx368r （GC）對(duì)所有厭氧氨氧化菌屬16S rRNA擴(kuò)增。引物序列及來(lái)源見(jiàn)表1。

PCR反應(yīng)體積為25 μL，10×PCR buffer（含Mg2+）2.5 μL，10 mmol·L-1dNTP 2.5 μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.3 μL，10 μmol·L-1引物各0.2 μL，DNA模板0.5 μL（約10～100 ng），最后加無(wú)菌ddH2O 18.8 μL。第一輪PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，Tm值溫度下退火1 min，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)，再以72℃延伸10 min。第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作第二輪PCR模板。第二輪PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，Tm值溫度下退火50 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。以上3對(duì)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

DGGE分析采用DCodeTM系統(tǒng)（Bio-Rad公司），并用8%聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺?雙炳烯酰胺=37.5?1 m·V-1）電泳，PCR產(chǎn)物加樣量25 μL，其中引物組合Amx368f（GC）/Amx820r利用凝膠變性劑濃度范圍為25%～55%，引物組合Pla46f/ Amx368r（GC）利用凝膠變性劑濃度范圍為40%～ 60%。電泳運(yùn)行條件：1×TAE電泳緩沖液，60℃恒溫，恒壓100 V，電泳12 h。電泳結(jié)束后，DGGE凝膠用硝酸銀染色，回收目的片段條帶，溶于去離子水中。12 h后以特異引物Amx368f/Amx820r和Pla46f/ Amx368r分別對(duì)回收DNA再次PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增后產(chǎn)物測(cè)序，所獲得序列均提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，基因登錄號(hào)為KT003616-KT003626。

1.5 DGGE圖譜分析

根據(jù)DGGE圖譜及Quantity One 4.6.2軟件對(duì)圖譜條帶分析，由公式（1）計(jì)算每個(gè)堆肥樣品中微生物多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener，H），預(yù)測(cè)堆肥樣品中厭氧氨氧化菌分布。

表1　試驗(yàn)所用PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

式中，Pi=Ni/N，Ni-樣品上各條帶吸收峰面積，N-樣品上所有條帶吸收峰總面積。

運(yùn)用Quantity one 4.6.2軟件UPGAMA對(duì)DGGE圖譜聚類分析，并應(yīng)用SPSS 21.0軟件對(duì)堆肥樣品DGGE圖譜進(jìn)行主成分分析（PCA）。

1.6系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

利用Blast程序?qū)Ψ蛛x到的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列比對(duì)，運(yùn)用MEGA（version6.06）[24]中NJ（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用Maximum Likelihood計(jì)算，Bootstrap分析值為1 000個(gè)樣本。

2　結(jié)果與分析

2.1厭氧氨氧化菌DGGE圖譜分析

以來(lái)自不同堆肥樣品DNA為模板進(jìn)行第一輪PCR，再以第一輪PCR產(chǎn)物為第二輪PCR模板擴(kuò)增，比較PCR產(chǎn)物DGGE圖譜發(fā)現(xiàn)，雖然不同樣品電泳圖在同一位置上有相同條帶，但其條帶粗細(xì)、信號(hào)強(qiáng)度不同，說(shuō)明不同種屬在堆肥發(fā)酵不同階段數(shù)量存在一定差異（見(jiàn)圖1）。測(cè)序結(jié)果表明，圖1A檢測(cè)到的DGGE條帶中，條帶A和K存在于整個(gè)堆肥過(guò)程，是堆肥優(yōu)勢(shì)類群。堆肥發(fā)酵不同階段樣品含有許多特異條帶，如F和G分別是Day7和Day13特異條帶，H主要存在于堆肥前期（Day0和Day1），B主要出現(xiàn)在高溫期（Day3和Day7），C主要出現(xiàn)在堆肥后期（Day13、Day23和Day29）。圖1B中，條帶C和I存在于每個(gè)堆肥樣品中，是優(yōu)勢(shì)類群。B和J主要出現(xiàn)在堆肥腐熟階段（Day23和Day29），A、D、K和L主要出現(xiàn)在堆肥前期（Day0和Day1），E和M主要出現(xiàn)在高溫期（Day3和Day7），F(xiàn)、B和J主要出現(xiàn)在堆肥后期（Day13、Day23和Day29）?？梢?jiàn)，A、D、H、K和L在堆肥前期起作用，B、E和M在高溫期起作用，F(xiàn)、B和J在堆肥后期起作用。

2.2 DGGE圖譜多樣性分析

利用以上Quantity One軟件分析DGGE圖譜多樣性，得出不同引物組合檢測(cè)堆肥不同階段樣品菌群多樣性指數(shù)H。結(jié)果表明，引物組合Amx368f/ Amx820r的PCR檢測(cè)中，堆肥高溫期（Day7）多樣性指數(shù)最高，腐熟期（Day29）多樣性指數(shù)最低。引物組合Pla46f/Amx368r的PCR檢測(cè)中，降溫期（Day13）厭氧氨氧化菌多樣性指數(shù)最高，腐熟期（Day29）多樣性指數(shù)最低（見(jiàn)圖2）。

2.3系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

將本研究獲得DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)相似序列比對(duì)，MEGA軟件構(gòu)建樹狀圖。結(jié)果表明，引物組合Amx368f/Amx820r檢測(cè)到的厭氧氨氧化菌主要為Candidatus Brocadia、Candidatus Scalindua和Candidatus Kuenenia三個(gè)屬，其中多數(shù)厭氧氨氧化菌相似于Candidatus Brocadia屬。F、E、C、A 和D類似于Candidatus Brocadia屬厭氧氨氧化菌，其中A和C與已知Candidatus Brocadia屬厭氧氨氧化菌相似性較高，分別為95%（AF375994）和98% （KF810110）；而E和D與已知Candidatus Brocadiafulgida相似性僅為90%和91%。H和G與Candidatus Scalindua屬厭氧氨氧化菌相近（主要來(lái)自河口沉積物）[25]，H與Candidatus Scalindua wagneri相似性為95%，G與Candidatus Scalindua marina相似性達(dá)96%。K與Candidatus Kuenenia屬的Candidatus Kuenenia stuttgartiensis相似性達(dá)95%。J、I和B類似于不可培養(yǎng)的Planctomycetes細(xì)菌（見(jiàn)圖3）。

引物組合Pla46f/Amx368r檢測(cè)到的G、J、A、 M、D、H和B均相似于Candidatus Brocadia屬厭氧氨氧化菌，但與已知菌屬相似性較低，只有M與已知Candidatus Brocadia caroliniensis相似性最高，為94%。C、K和F與Candidatus Scalindua屬厭氧氨氧化菌相似，其中C與Candidatus Scalindua wagneri相似性達(dá)95%。I相似于Candidatus Kuenenia屬厭氧氨氧化菌。此系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中同樣存在不可培養(yǎng)的Planctomycetales細(xì)菌，即E和L（見(jiàn)圖4）。

圖1　堆肥中厭氧氨氧化菌16S rRNA基因DGGE圖譜Fig.1 16S rRNA gene DGGE profile of anammox bacteria

圖2　厭氧氨氧化菌16S rRNA基因多樣性指數(shù)Fig.2 16S rRNA gene Shannon-Winner index of anammox bacteria

圖3　引物Amx368f/Amx820r擴(kuò)增所得到序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenitic tree showing the affiliations phylotypes using primer Amx368f/Amx820r

圖4　引物Pla46f/Amx368r擴(kuò)增所得序列系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenitic tree showing the affiliations phylotypes using primer Pla46f/Amx368r

3　討　論

在水體生態(tài)系統(tǒng)中，厭氧氨氧化過(guò)程所需亞硝態(tài)氮由硝化作用提供[26]。堆肥系統(tǒng)中，盡管高溫期銨態(tài)氮大量揮發(fā)，但硝化作用和反硝化作用仍可提供充足亞硝態(tài)氮，亞硝態(tài)氮和銨態(tài)氮同時(shí)存在厭氧環(huán)境條件[27]，厭氧氨氧化反應(yīng)即可發(fā)生。堆肥后期，雖然硝態(tài)氮含量增多，但銨態(tài)氮越來(lái)越少[19]，反硝化細(xì)菌數(shù)量增多[28]，可能與厭氧氨氧化菌協(xié)同抑制[29]，故厭氧氨氧化菌數(shù)量不斷減少，多樣性降低。本研究結(jié)果顯示，牛糞堆肥過(guò)程中各時(shí)期均存在厭氧氨氧化菌，堆肥過(guò)程中厭氧氨氧化菌多樣性整體呈先升后降趨勢(shì)，多樣性較高的樣品包括Day7（高溫期）和Day13（降溫期），樣品Day7多樣性高說(shuō)明厭氧氨氧化菌存在于堆肥高溫環(huán)境中，主要菌屬為Candidatus Brocadia。Byrne指出厭氧氨氧化菌可存在于85℃高溫[30]，主要菌屬是Candidatus Brocadia和Candidatus Kuenenia，與本研究結(jié)果吻合。Candidatus Scalindua屬主要出現(xiàn)在堆肥初期及后期，可能與其適合較低溫度環(huán)境，如稻田有關(guān)[17]。而在降溫期（Day13）厭氧氨氧化菌多樣性同樣較高，可能與堆體溫度下降，適合多種細(xì)菌生長(zhǎng)有關(guān)（特別是硝化細(xì)菌）。

分析細(xì)菌16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，引物Amx368f/Amx820r經(jīng)PCR得到的DNA序列與引物Pla46f/Amx368r經(jīng)PCR得到序列存在一定差異，前者獲得序列與已知厭氧氨氧化菌序列相似性更高。與已知菌相似性達(dá)90%～99%，而后者獲得序列與本研究測(cè)得序列中僅M和C與已知厭氧氨氧化菌相似性高于90%，表明利用引物Amx368f/ Amx820r PCR更有利于擴(kuò)增出與已知序列高同源性的厭氧氨氧化菌，與Sànchez-Melsió等研究結(jié)果一致[31]。

4　結(jié)　論

a.通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)驗(yàn)證厭氧氨氧化菌存在于牛糞與稻草秸稈混合堆肥中，即存在于整個(gè)堆肥過(guò)程。

b.堆肥發(fā)酵過(guò)程中高溫期（Day7）和降溫期（Day13）厭氧氨氧化菌多樣性較高。

c.堆肥發(fā)酵不同時(shí)期厭氧氨氧化菌群發(fā)生更替。

d.本研究檢測(cè)到的厭氧氨氧化菌主要屬于Candidatus Brocadia、Candidatus Scalindua和Candidatus Kuenenia三個(gè)屬，其中Candidatus Brocadia屬厭氧氨氧化菌占大多數(shù)。

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Molecular detection of anaerobic ammonium oxidation bacteria in cow manure composting

XU Xiuhong,WANG Tingting,MENG Qingxin,SUN Xuewei,CHENG Lijun,ZHANG Wenhao,SUN Yu,REN Guangming,ZHU Liping,WANG Ziqi,HE Ning(School of Resources and Environmental Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Abstract:In this study,the species and diversity of anammox bacteria 16S rRNA gene in composting process were detected by PCR- DGGE technology.The results showed that anammox bacterial genera in cow manure composting were different from the marine environment.Candidatus Scalindua was dominat anammox bacteria in marine environment,while Candidatus Brocadia,Candidatus Kuenenia and Candidatus Scalindua were dominant anammox bacteria in cow manure compost,and anammox bacteria diversity was relatively high.This study provided the molecular evidence for the existence of anammox during the composting process.

Key words:anammox bacteria; compost; PCR-DGGE

作者簡(jiǎn)介：許修宏（1968-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)。E-mail:xuxiuhong@neau.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272484，31372351）

收稿日期：2015-12-06

中圖分類號(hào)：S141.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1005-9369（2016）03-0052-07