王強，林結(jié)雙

（廣西民族師范學(xué)院，廣西崇左532200）

2-乙酰吡啶縮L-蛋氨酸銅（Ⅱ）配合物的合成、表征及與DNA相互作用

王強，林結(jié)雙

（廣西民族師范學(xué)院，廣西崇左532200）

將2-乙酰吡啶與L-蛋氨酸在乙醇作為溶劑的情況下混合，并用氫氧化鉀調(diào)節(jié)其pH，二者通過縮合反應(yīng)，得到2-乙酰吡啶縮L-蛋氨酸配體。在此基礎(chǔ)上，將配體與三水合硝酸銅進(jìn)行反應(yīng)，合成了銅配合物，使用紫外和紅外光譜等手段對其進(jìn)行表征。此外，選用紫外和熒光光譜法對配合物與DNA相互作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明配合物和DNA作用的模式是插入模式。

2-乙酰吡啶；L-蛋氨酸；結(jié)構(gòu)表征；DNA作用

研究表明，醫(yī)學(xué)上研究的某些有機(jī)物在抗癌、抗菌、抗炎等諸多方面發(fā)揮著越來越重要的作用，這類有機(jī)物通常都是含有-N=CH-基團(tuán)。然而，當(dāng)這些有機(jī)化合物與某些金屬鹽在溫和條件下進(jìn)行回流反應(yīng)時，所得產(chǎn)物的抗癌作用將會大大增強[1]38-39，研究人員對此產(chǎn)生了濃厚的興趣，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了深入的研究，給醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、藥物領(lǐng)域等的創(chuàng)新和發(fā)展，提供了不可或缺的作用，開辟了新的途徑。氨基酸是人類必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，可以用來合成蛋白質(zhì)、酶和激素等物質(zhì)，它是重要的兩性物質(zhì)，既含有氨基也有羧基，它這一特殊的結(jié)構(gòu)決定了它具有很強的生理活性，可以和很多物質(zhì)結(jié)合，進(jìn)而得到理想的產(chǎn)物，給人類的生產(chǎn)生活以及生物化學(xué)過程帶來了極大的幫助[2]74-78。本實驗所用的氨基酸是甲硫氨酸也叫蛋氨酸，是組成人體的必需氨基酸之一，參與蛋白質(zhì)的合成，但不能在體內(nèi)自動合成，必須從外部獲取。研究人員根據(jù)蛋氨酸所特有的氨基，將其與含羰基類的化合物如醛或酮在既定的條件下發(fā)生反應(yīng)，即可得到具有多個強電負(fù)性的配位原子如N、O等的配體希夫堿，又將希夫堿配體和過渡金屬鹽進(jìn)行配合，所得配合物的生物活性及其催化作用，經(jīng)過不斷的驗證后發(fā)現(xiàn)，該配合物對生物化學(xué)和醫(yī)藥化學(xué)的研究意義非凡[3-4]118-119,422-424。例如，桂自其、田君濂合成的甲酰基甲酸氨硫脲希夫堿配合物對細(xì)菌的殺滅效果非常明顯，而且形態(tài)各異，各有所長；華中師范大學(xué)化學(xué)系與湖北腫瘤醫(yī)院合作，通過持續(xù)不斷的研究后發(fā)現(xiàn)，希夫堿類化合物對人體各種癌癥的抑制作用效果顯著，為推動我國抗癌事業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展做出了極大的貢獻(xiàn)[5]43-46。

正因為氨基酸希夫堿及其金屬配合物具有良好的殺菌抗癌性能，研究人員對這方面的研究熱度頗高。近年來，人們對希夫堿進(jìn)行了更深層次的探討后發(fā)現(xiàn)，氨基酸希夫堿同時還具有抗超氧離子自由基的特性，而且我們知道有些腫瘤、癌癥正是因為人的體內(nèi)超氧離子自由基O2-過多而引發(fā)的，此外，O2-過多也會造成某些炎癥和衰老。一些研究專家通過不斷的試驗后發(fā)現(xiàn)，某些金屬鹽與希夫堿所形成的配合物對超氧離子自由基有很明顯的抑制性能，而且，希夫堿本身也能對超氧離子自由基起到清除的效果。除此以外，部分希夫堿和它的金屬配合物特有的發(fā)光性、光致變色性等諸多性質(zhì)標(biāo)志著這類有機(jī)物在科技和材料的研發(fā)方面前景非常廣闊，很多科學(xué)家也在不斷地進(jìn)行這方面的研究，成果顯著[6-7]65-69,98-100。

吡啶類物質(zhì)生理活性較好，研究價值非常高，一直以來都是科研人員青睞的對象[8]451-460，其中，在眾多吡啶類物質(zhì)中，2-乙酰吡啶是一種非常優(yōu)良的有機(jī)化合物，它與蛋氨酸化合形成的希夫堿配體及其金屬配合物，操作簡潔明了，反應(yīng)溫和，應(yīng)用廣泛涉及多個領(lǐng)域[9]266-267,270。文章采用L-蛋氨酸和2-乙酰吡啶，通過回流冷凝法，在非常溫和的條件下，合成了2-乙酰吡啶縮L-蛋氨酸希夫堿配體，并將配體與三水合硝酸銅進(jìn)行化合，合成了四種金屬配合物，然后通過測定摩爾電導(dǎo)率、以及運用紫外可見光光譜法、紅外光譜法分別對四種金屬配合物進(jìn)行表征。另外，DNA與配合物之間的作用，選用紫外可見吸收光譜和熒光光譜法對其進(jìn)行研究。

一、實驗部分

（一）主要儀器與試劑

DDA-11A型電導(dǎo)率儀（上海金萬儀器表有限公司）；RF-5301PC熒光分光光度計（日本島津有限公司）；UV 6100S型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；紅外光譜儀（天津拓普儀器有限公司）。

所用試劑均為市售分析純或化學(xué)純試劑，未進(jìn)一步純化。

（二）配體與金屬配合物的合成

1.配體的合成

稱取質(zhì)量為1.3690 g的L-蛋氨酸和0.5038 g的氫氧化鉀固體置于150 mL的圓底燒瓶中，并向燒瓶中加入20 mL無水乙醇，2滴蒸餾水，之后將燒瓶放到磁力攪拌器中，調(diào)節(jié)溫度為40℃，加熱攪拌0.5 h后，趁熱過濾。隨后將濾液倒入另一燒瓶中，用恒壓滴液漏斗向其緩慢滴加1 mL(1.0812g)的2-乙酰吡啶的無水乙醇（20 mL）溶液，在65℃下攪拌回流3 h。回流結(jié)束后冷卻至室溫，靜置2天，過濾，用無水乙醇洗滌2-3次，得到淺黃色固體，常溫下干燥保存。

2.金屬配合物的合成

稱取三水合硝酸銅（Cu(NO3)2·3H2O）固體0.5973 g放入250 mL的圓底燒瓶中，并向其加入10 mL的無水乙醇，用玻璃棒攪拌溶解。用量筒量取15 mL配體溶液于恒壓滴液漏斗中，以每秒2-3滴的速度滴入燒瓶，然后將燒瓶置于磁力攪拌器中，調(diào)節(jié)溫度為65℃，攪拌回流6小時?；亓鹘Y(jié)束后，將溶液趁熱倒入100 mL燒杯中，冷卻靜置兩天后，過濾，得到淺黃色固體，常溫下真空保存。

（三）配合物的結(jié)構(gòu)表征

1.摩爾電導(dǎo)率的測定

分別取少量金屬配合物的固體溶解于無水乙醇當(dāng)中，使其濃度約為l.02×10-4mol·L-1時，使用電導(dǎo)率儀進(jìn)行測定，其摩爾電導(dǎo)率為15.52 S·cm2·mol-1。其值小于35 S·cm2·mol-1，可以判斷出這些金屬配合物為非電解質(zhì)，而金屬硝酸鹽中的硝酸根參與了配位[10]73-79。

2.紫外-可見吸收光譜掃描

分別取少量配體及金屬配合物固體，溶解于無水乙醇中，在比較溫和的條件下，用無水乙醇作參比溶液，設(shè)置掃描波長為200nm～600 nm，使用UV-6100S型紫外可見分光光度計分別對上述溶液進(jìn)行掃描，所得光譜圖如圖1所示。

圖1 配體與配合物UV光譜圖

從圖1中可知，2-乙酰吡啶縮L-蛋氨酸配體的吸收曲線在305.5nm處有最高峰，并且該峰非常強烈，而碳氮單鍵（C=N）的紫外吸收峰范圍在200～400nm，該配體的吸收峰恰好出現(xiàn)在這個范圍內(nèi)，因此能夠解釋該配體已經(jīng)形成了碳氮單鍵（C=N），屬于希夫堿類物質(zhì)。當(dāng)吡啶縮L-蛋氨酸和銅金屬鹽溶液進(jìn)行作用后，其吸收曲線的吸收峰發(fā)生了一定的紅移，均有向右移動的趨勢。在第一個吸收峰處，移動9nm；而第二個吸收峰處，移動10.5nm、，進(jìn)一步表明，2-乙酰吡啶縮L-蛋氨酸希夫堿配體與銅離子發(fā)生了配位，希夫堿配合物已經(jīng)形成。

3.紅外光譜掃描

設(shè)置波長的掃描范圍為4000～450 cm-1，對配體與配合物分別進(jìn)行紅外光譜掃描，所得譜圖如圖2、圖3所示。

圖2 IR配體的紅外光譜圖

圖3 IR銅配合物的紅外光譜圖

表1 配體和配合物主要的紅外光譜峰值（cm-1）

結(jié)合圖2、3以及表1中的數(shù)據(jù)可得知：

（1）配體及其配合物在3300cm-1處并沒有出現(xiàn)類似馬鞍形的兩個吸收峰，因此可以斷定，在配體及其配合物中并不存在伯胺基、仲氨基這樣的結(jié)構(gòu)。但在3000-3500 cm-1范圍內(nèi)卻出現(xiàn)較寬的峰，由此可推測，這峰可能是合成碳氮雙鍵時，脫去的水分子中的羥基發(fā)生振動所致，但也有可能是乙醇中的羥基發(fā)生振動[11-12]92,463-466。另外，在1000-800cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)了較明顯的峰，這說明配合物中有水產(chǎn)生。

（2）與此同時，在2820-2729cm-1處，沒有明顯的吸收峰，說明吡啶環(huán)上的醛基已經(jīng)與蛋氨酸上的氨基發(fā)生了反應(yīng)，有可能產(chǎn)生碳氮雙鍵。

（3）經(jīng)查閱資料可知，碳氮雙鍵（亞氨基）在1690-1630cm-1范圍內(nèi)存在較強的吸收峰，而本次實驗合成的配體當(dāng)中，碳氮雙鍵的峰值為1654.8cm-1，剛好在這個范圍內(nèi)，并且，在配體與金屬鹽結(jié)合后，形成的配合物中，出現(xiàn)的碳氮雙鍵峰值為1656.9cm-1，相對于配體而言，發(fā)生了一定的位移[13]58-60。

（4）配體和金屬鹽反應(yīng)后，所得金屬配合物出現(xiàn)了新的吸收峰，也就是M-N的伸縮振動,峰值為：778 cm-1，除此以外，又在512 cm-1處出現(xiàn)了配體中未出現(xiàn)的新的譜帶為M-O的特征吸收峰，由此可以說明這四種金屬離子都分別與2-乙酰吡啶縮L-蛋氨酸希夫堿配體中的N、O原子發(fā)生了配位。綜上所述，該反應(yīng)合成了希夫堿配體，并且該配體與金屬鹽發(fā)生了配位反應(yīng)。

4.配合物可能的結(jié)構(gòu)

根據(jù)以上的數(shù)據(jù)及其圖表分析，可以初步得出配合物的結(jié)構(gòu)可能為：

圖4 金屬配合物可能的結(jié)構(gòu)圖

二、配合物與DNA作用的研究

（一）溶液的配制

1.緩沖溶液的配制：用電子天平稱量質(zhì)量為0.6057g的三羥甲氨基甲烷固體，以及2.9220g的氯化鈉，放入1000mL燒杯中,加入適量蒸餾水，攪拌溶解后，立即用pH計測定溶液的pH，滴加少量事先配制好的1mol/L的鹽酸，用以調(diào)節(jié)溶液的pH，直至其pH為7.2。隨后，將溶液通過玻璃棒引流，轉(zhuǎn)入到1000mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻便可。

2.魚精DNA溶液的配制：用電子天平量取質(zhì)量為0.0122g的魚精DNA固體于100mL的燒杯中，立即倒入適量的事先配制好的緩沖溶液，將其快速溶解，隨后將溶液轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用緩沖溶液進(jìn)行定容，搖勻即可。

3.金屬配合物溶液的配制：用電子天平分別稱量0.0015 g的金屬配合物固體，用事先配好的緩沖溶液進(jìn)行溶解，使各金屬配合物的濃度接近2.80×10-4mo l/L，以緩沖溶液定容于100mL容量瓶中，搖勻即可。

（二）配合物與DNA相互作用的研究方式

1.紫外-可見吸收光譜掃描

用規(guī)格為5mL的吸量管分別量取2.5mL金屬配合物溶液于五個25mL的容量瓶中，然后，向五個容量瓶中分別加入不同濃度的魚精DNA溶液：以0.0mL的DNA溶液為起點，做空白試驗，以1mLDNA溶液為梯度，不斷增加DNA溶液的體積，直至DNA溶液的體積增至5mL時，用事先準(zhǔn)備好的緩沖溶液依次進(jìn)行定容，搖勻后，把配制好的溶液放到陰暗處保存12小時。隨后，使用紫外-可見吸收光譜進(jìn)行掃描，選取緩沖溶液作為參比溶液，設(shè)置掃描波長為200～600nm，分別進(jìn)行掃描。

IPA重要性和表現(xiàn)性分析法是1977年由Martilla 和 James所提出一種滿意度評測模型工具，其基本思想是顧客對產(chǎn)品/服務(wù)的滿意度來自于其對于該產(chǎn)品/服務(wù)各屬性的重視程度，以及對各屬性績效表現(xiàn)程度的評價[5].IPA分析法有助于理解顧客滿意度并明確服務(wù)質(zhì)量應(yīng)優(yōu)先改進(jìn)的領(lǐng)域，方法簡單實用，分析結(jié)果易于理解，自上個世紀(jì)90年代開始被廣泛運用到服務(wù)業(yè)之中用以分析產(chǎn)品或服務(wù)優(yōu)劣勢，提升服務(wù)質(zhì)量和提高顧客滿意[6].

圖5 銅配合物在CDNA/CComplex增大體系中的UV譜圖

2.熒光光譜掃描

用規(guī)格為5mL的吸量管分別量取2.5mL金屬配合物溶液于五個25mL的容量瓶中，然后，向五個容量瓶中分別加入不同濃度的魚精DNA溶液：以0.0mL的DNA溶液為起點，做空白試驗，以1mL DNA溶液為梯度，不斷增加DNA溶液的體積，直至DNA溶液的體積增至5mL時，用事先準(zhǔn)備好的緩沖溶液依次進(jìn)行定容，搖勻后，把配制好的溶液放到陰暗處保存12小時。隨后，使用熒光分光光度計進(jìn)行掃描，選取緩沖溶液作為參比溶液，設(shè)置5nm的裂縫，二維為240nm/min，發(fā)射波長為350nm～450nm,激發(fā)波長為300nm～400nm，分別進(jìn)行熒光掃描。

圖6 銅配合物在CDNA/CComplex增大體系中熒光激發(fā)圖

（三）配合物與DNA相互作用結(jié)果的討論和分析

1.配合物與DNA作用的紫外-可見吸收光譜掃描和分析

從圖5可發(fā)現(xiàn)，金屬配合物的紫外吸收峰在不斷升高，而且落在了285nm到290nm之間。另外，在加入DNA，并且隨著DNA溶液濃度逐漸增大，曲線的紅移現(xiàn)象越發(fā)明顯，因此，可以說明，上述金屬配合物都DNA發(fā)生了插入作用[14]86-88。

2.配合物與DNA相互作用的熒光光譜掃描分析

在保證金屬配合物濃度一致的情況下，逐漸增加DNA溶液的濃度，分別測定溶液的發(fā)射光譜和激發(fā)光譜。據(jù)圖6可知，隨著加入DNA的濃度不斷增加，配合物溶液的發(fā)射光譜和激發(fā)光譜也存在著逐漸增加的趨勢，并且，與空白溶液即未加DNA的溶液進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，加入DNA的配合物溶液的發(fā)射峰產(chǎn)生了微小的紅移，由此可以說明，配合物與DNA進(jìn)行了相互作用，導(dǎo)致DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化。而此時，配合物的熒光強度在不斷增加，說明配合物的基團(tuán)由親水性轉(zhuǎn)入了疏水性，從而可以推測出金屬配合物與DNA作用的方式是插入模式。

結(jié)語

經(jīng)過不斷的試驗，發(fā)現(xiàn)了2-乙酰吡啶縮L-蛋氨酸配體及其金屬配合物的最佳合成路線，即在一定條件下，先固定溫度為40℃，并不停地進(jìn)行攪拌，等L-蛋氨酸在無水乙醇溶液中逐漸溶解后，再緩慢滴加2-乙酰吡啶的無水乙醇溶液，隨后把溫度升高到65℃，回流反應(yīng)3h即得到目標(biāo)配體。將配體靜置兩天后，調(diào)節(jié)磁力攪拌器的溫度為65℃，將配合物的無水乙醇溶液滴加到配體的無水乙醇溶液中，回流反應(yīng)6h，便可制得配合物。選用紫外、摩爾電導(dǎo)率以及紅外等的檢測方式，推測出了配合物可能的結(jié)構(gòu)。根據(jù)DNA濃度的不同對配合物的活性進(jìn)行了探究，最后發(fā)現(xiàn)DNA與金屬配合物的作用方式是插入模式。

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責(zé)任編輯：李凡生

Study on the Synthesis,Characterization and Interaction with DNA from 2-acetyl Pyridine Condensing L-methionine Cu（Ⅱ）Complexes

WANG Qiang,LIN Jie-Shuang
(Guangxi Normal University for Nationalities,Guangxi Chongzuo,532200)

Under the condition of mixing 2-acetyl Pyridine with L-Methionine in ethanol as solvent,and with potassium hydroxide to adjust its pH,2-aceto-pyridine condensation L-Methionine ligands can be obtained by the condensation reaction.On this basis,complexes of different synthesis can be obtained by the ligand respectively with Cu(NO3)2o3H2O,and Cu（Ⅱ）complexes was characterized by IR and UV spectra method.In addition,using IR and UV spectra method to study the interaction between the complexes and DNA,the results show that DNA and metal complexes of action is in insert mode.

2-acetyl Pyridine，L-Methionine;structural characterization，interaction with DNA

O621.4

A

1674-8891（2016）03-0007-04

2016-04-11

2013年度廣西高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項目（編號：2013YB265）；廣西民族師范學(xué)院人才科研啟動項目（編號∶2012RCBS001）。

王強(1973-)，男，廣西玉林人，博士，廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程系副教授，研究方向：有機(jī)合成、功能配合物。