郭宏文+王艷+江成英+郭建華

摘要： 以從黑龍江省齊齊哈爾市北大倉(cāng)酒廠白酒酒醅中分離篩選到的產(chǎn)酸性α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌菌株C6為出發(fā)菌，利用紫外線、硫酸二乙酯作為誘變劑對(duì)其進(jìn)行了復(fù)合誘變，制作致死率曲線確定誘變劑量，紫外線誘變照射時(shí)間為40 s，硫酸二乙酯誘變處理時(shí)間為20 min。通過(guò)初篩、復(fù)篩發(fā)酵，從大量的突變株中篩選到1株產(chǎn)酸性α-淀粉酶活力較高的菌株F21，在pH值為4.6條件下，α-淀粉酶活力達(dá)996.2 U/mL，比原菌株提高了2.56倍。產(chǎn)酶穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，菌株F21產(chǎn)酶能力穩(wěn)定，可以作為酸性α-淀粉酶育種研究的良好菌株。

關(guān)鍵詞： 酸性α-淀粉酶；紫外線誘變；硫酸二乙酯誘變；突變株

中圖分類號(hào)： Q933 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0356-02

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，淀粉產(chǎn)量高，淀粉深加工業(yè)發(fā)展前景十分廣闊。酸性α-淀粉酶是一種能夠在較低的pH值環(huán)境下液化淀粉的酶類，被廣泛應(yīng)用在發(fā)酵、食品、紡織、飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域，開(kāi)發(fā)新型的酸性α-淀粉酶具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。自1963年日本學(xué)者M(jìn)inoda等發(fā)現(xiàn)了黑曲霉可以用于生產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶[1]以來(lái)，許多國(guó)家對(duì)酸性 α- 淀粉酶開(kāi)展了研究。我國(guó)學(xué)者從20世紀(jì)90年代開(kāi)始對(duì)酸性 α-淀粉酶進(jìn)行研究，近年來(lái)相關(guān)研究主要集中在基因工程菌構(gòu)建、菌種選育等方面[2-5]。為了得到優(yōu)良的生產(chǎn)菌種，從自然界篩選及進(jìn)行誘變選育仍是目前工業(yè)微生物育種的有效手段。筆者以從黑龍江省齊齊哈爾市北大倉(cāng)酒廠白酒酒醅中篩選到的產(chǎn)酸性α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌菌株C6為研究對(duì)象[6]，通過(guò)紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合誘變，獲得產(chǎn)酶能力強(qiáng)的酸性α-淀粉酶突變株，旨在為開(kāi)發(fā)利用酸性α-淀粉酶資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）C6分離自白酒酒醅。平板篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉 10 g，蛋白胨5 g，Na2HPO4 0.1 g，KH2PO4 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 1 g，瓊脂1.8 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。產(chǎn)酶種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉 12 g，蛋白胨8 g，酵母粉2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4 1 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉15 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4 1 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

1.2 主要試劑及儀器

試驗(yàn)用硫酸二乙酯等試劑均為分析純。TU-1810紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（普析通用公司）；紫外誘變箱，自制；Hermle高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)哈默公司）；RH-Q恒溫振蕩器（金壇市榮華儀器制造有限公司）；SYQ-DSX-280壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.3 紫外誘變處理

在紫外誘變箱內(nèi)進(jìn)行誘變，菌懸液距離15 W紫外燈 30 cm，磁力攪拌同時(shí)照射不同的時(shí)間，對(duì)處理液進(jìn)行稀釋后涂布于平板篩選培養(yǎng)基，放在32 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)1～2 d。通過(guò)對(duì)平板菌落計(jì)數(shù)計(jì)算致死率，選定最佳誘變劑量進(jìn)行誘變。

1.4 硫酸二乙酯（DES）誘變處理

三角瓶中分別加入磷酸緩沖液15 mL、待處理菌懸液 5 mL 及硫酸二乙酯溶液0.2 mL，置于36 ℃振蕩器內(nèi)處理不同時(shí)間。取出1 mL處理液，加入1 mL 25% 硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。將處理液稀釋后涂布于平板篩選培養(yǎng)基，放在 32 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)1～2 d。通過(guò)對(duì)平板菌落計(jì)數(shù)計(jì)算出致死率，確定最佳誘變劑量并進(jìn)行誘變[7]。

1.5 突變株初篩

用稀碘液對(duì)分離平板上生長(zhǎng)的菌落顯色，計(jì)算菌落透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d值），選出比出發(fā)菌株的D/d值增加10%以上的菌株，初步認(rèn)為其發(fā)生了正突變，挑至斜面保存。

1.6 液態(tài)發(fā)酵

250 mL三角瓶中裝有25 mL種子培養(yǎng)基，接種后置于 36 ℃ 搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，取出2 mL種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，置于36 ℃搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液用4層紗布過(guò)濾，測(cè)定濾液酶活力。

1.7 酶活力的測(cè)定

參照Yoo等的改良法[8-9] 進(jìn)行酶活力的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變劑量的確定

由圖1可以看出，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，紫外線誘變致死率逐漸增加。照射40、60、100 s的致死率分別為75.9%、91.3%、100%。依據(jù)誘變育種產(chǎn)量變異中多傾向于使用較低劑量的原則，本試驗(yàn)選取致死率為70%～80%的誘變劑量，確定用紫外線照射時(shí)間為40 s的劑量進(jìn)行誘變處理。

2.2 硫酸二乙酯誘變劑量的確定

由圖2可以看出，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，DES誘變致死率逐漸增加。處理時(shí)間為20、30、50 min時(shí)致死率分別為 78.6%、88.7%、100%。本試驗(yàn)選用致死率為70%～80%的誘變劑量，確定硫酸二乙酯誘變的處理時(shí)間為20 min。

2.3 紫外線誘變篩選結(jié)果

對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行了多次紫外線誘變，通過(guò)初篩的方法選出了100株突變株，對(duì)它們進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)測(cè)定其產(chǎn)酶能力，結(jié)果表明，65株突變株的酶活比原出發(fā)菌株有所提高，從中篩選出1株酶活力高且產(chǎn)酶穩(wěn)定的突變株A1，酶活力達(dá)到 688.5 U/mL，比出發(fā)菌株C6提高了1.77倍。突變株的菌落形態(tài)及顏色與誘變前的出發(fā)菌株一致。

2.4 硫酸二乙酯誘變篩選結(jié)果

對(duì)紫外誘變篩選出的突變株A1進(jìn)行了多次DES誘變，通過(guò)初篩選出了150株突變株，對(duì)它們進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)測(cè)定其產(chǎn)酶能力，其中有72株突變株酶活比A1有所提高，產(chǎn)酶能力高的5株突變株分別為E32、F21、E8、F17、F61，酶活依次為1 053.1、997.1、932.2、906.3、876.1 U/mL，突變株E32的酶活比出發(fā)菌株A1提高了1.53倍。這些突變株的菌落形態(tài)及顏色與誘變前的出發(fā)菌株一致。

2.5 突變株的產(chǎn)酶穩(wěn)定性結(jié)果

將酶活最高的E32等5株突變株連續(xù)傳代9次，用第1、3、5、7、9代菌株發(fā)酵產(chǎn)酶，測(cè)定酶活力，數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。由表1可知，突變株E32、E8、F17、F61的產(chǎn)酶能力不穩(wěn)定，隨著代數(shù)增加均有所下降，突變株F21的產(chǎn)酶能力穩(wěn)定。可以選用突變株F21用作以后發(fā)酵產(chǎn)酶的出發(fā)菌株。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，出發(fā)菌株C6對(duì)紫外線及硫酸二乙酯的處理均比較敏感，容易產(chǎn)生突變及死亡。紫外誘變的效果好于硫酸二乙酯誘變。針對(duì)產(chǎn)酸性α-淀粉酶的菌株C6進(jìn)行了復(fù)合誘變處理，效果良好，出發(fā)菌株C6的酶活為 389.2 U/mL，誘變篩選到的突變株F21的酶活達(dá)到996.2 U/mL，比誘變前提高了1.56倍。本試驗(yàn)結(jié)果為今后進(jìn)一步選育酸性α-淀粉酶的高產(chǎn)菌株打下了良好基礎(chǔ)。

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