王欣+陳晨+范洋洋+謝雨辰+錢平+唐順明+沈興家

摘要： 為了研究家蠶miRNAs對絲腺細(xì)胞因子SGF-1表達(dá)的調(diào)控作用，以SGF-1為靶基因，利用生物信息學(xué)軟件RNAhybrid和RNA22預(yù)測對SGF-1具有潛在調(diào)控作用的候選家蠶miRNAs，經(jīng)莖環(huán)PCR鑒定后分別構(gòu)建重組表達(dá)載體，在細(xì)胞水平研究家蠶miRNAs的功能。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了bmo-miR-305*重組質(zhì)粒組的luc熒光素酶活性比未轉(zhuǎn)染時(shí)極顯著下調(diào)（P<0.01）；轉(zhuǎn)染了bmo-miR-3327*重組質(zhì)粒組的luc熒光素酶活性比未轉(zhuǎn)染時(shí)極顯著下調(diào)（P<0.01）；再各自轉(zhuǎn)染了inhibitors后熒光蛋白表達(dá)量均上調(diào)（P<0.05）。說明SGF-1 3′UTR上存在bmo-miR-305*和bmo-miR-3327*的結(jié)合位點(diǎn)，且bmo-miR-305*和bmo-miR-3327*對SGF-1的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)具有一定抑制作用。

關(guān)鍵詞： 家蠶；miRNAs；絲腺轉(zhuǎn)錄因子；SGF-1；功能鑒定

中圖分類號： S881.2；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0053-06

microRNAs（miRNAs）作為重要的基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控因子，參與包括發(fā)育、代謝、疾病發(fā)生等各種重要的生理過程。目前國內(nèi)外在家蠶miRNAs上開展了相關(guān)研究，進(jìn)行了家蠶miRNAs的鑒定、表達(dá)譜分析以及功能預(yù)測。至2014年6月，miRBase數(shù)據(jù)庫（http：//www.mirbase.org/）21版本中已記錄223個物種的35 828條成熟體miRNAs，并且其數(shù)量還在不斷增長，其中，在家蠶中共發(fā)現(xiàn)487個miRNAs 前體和563個成熟體miRNAs。

大多數(shù)miRNAs主要通過與靶基因mRNA 3′端非翻譯區(qū)（3′UTR）的互補(bǔ)配對，在mRNA或翻譯水平負(fù)調(diào)控靶基因表達(dá)[1，2]。目前研究表明，miRNA 的負(fù)調(diào)控作用不僅存在于靶mRNA 的3′UTR 區(qū)，也可發(fā)生在5′UTR區(qū)[3]。前人研究認(rèn)為，所有的miRNAs調(diào)控作用都是負(fù)調(diào)控，但Vasudevan等研究發(fā)現(xiàn)miRNA具有激活基因表達(dá)的作用[4]。Hussain等也通過試驗(yàn)證明除了常見的下調(diào)靶基因轉(zhuǎn)錄水平，miRNAs能夠上調(diào)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平[5]。Miyoshi等還證實(shí)了miRNAs除了能夠作用于3′UTR外，還能夠結(jié)合在靶基因的其他位置[6-7]。

miRNA和轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）一樣，都能夠在轉(zhuǎn)錄水平獨(dú)立調(diào)控靶基因的表達(dá)水平，而越來越多的研究證明這兩者之間能夠通過相互作用更精準(zhǔn)地對靶基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。通過計(jì)算機(jī)分析預(yù)測，Enright等指出在眾多 miRNAs 的潛在靶基因中，TFs作為靶基因的可能性比一般基因大約高出2倍[8]。Cui等在研究基因調(diào)控中miRNAs與TFs的相互關(guān)系方面也作出了貢獻(xiàn)，認(rèn)為miRNAs更可能靶向含有大量TFs結(jié)合位點(diǎn)的基因，而這些基因通常也具有相對更多的miRNAs結(jié)合位點(diǎn)[9]。

SGF-1是絲腺特異性細(xì)胞因子[10]，存在于中、后部絲腺。SGF-1除了在絲素重鏈基因（Fib-H）、絲素輕鏈（Fib-L）和p25基因的上游有其結(jié)合位點(diǎn)外，還能與絲膠Ser1基因上游的SA區(qū)域結(jié)合[11]，說明SGF-1對家蠶絲蛋白基因的表達(dá)調(diào)控具有重要的作用，特別是在細(xì)胞特異性表達(dá)方面。而SGF-1自身的表達(dá)也要受到調(diào)控，為了驗(yàn)證家蠶miRNAs是否對SGF-1的表達(dá)具有調(diào)控作用，本研究以SGF-1 3′UTR為序列，利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測并獲得候選miRNAs，通過體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，初步篩選可能調(diào)控SGF-1的候選miRNAs，為進(jìn)一步研究miRNAs的功能提供依據(jù)，也為闡明蠶絲蛋白合成及調(diào)控機(jī)制積累試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

家蠶品種p50，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供；E.coli DH10B菌株、昆蟲BmN細(xì)胞系、重組表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3 [ie1-egfp-SV40]和重組表達(dá)載體質(zhì)粒PGL3[A3-luc-SV40]均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所農(nóng)業(yè)部蠶桑遺傳與改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存。

pMD18-T、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase、Ex Taq酶、PrimeScript RT-PCR Kit、RNAiso Plus和DNA maker均購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司；TC-100購自Applichem公司；Fetal Bovine Serum（Qualified，Australia Origin） 購自Gibco公司；UCallM PerFectTM購自藥科美公司；雙報(bào)告基因熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；miRNA inhibitors由百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成；其他化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)或生工生物工程（上海）有限公司；所有PCR引物合成與DNA測序由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 與SGF-1 3′UTR作用的候選家蠶miRNAs的獲得 通過NCBI查找到家蠶SGF-1的mRNA序列，（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001043864.1），獲得全長 3 078 bp 的核苷酸，其中cds全長1 049 bp，protein ID=“NP_001037329.1”，除去polyA signal，獲得SGF-1基因的3′非編碼區(qū)序列。通過miRBase數(shù)據(jù)庫中獲取家蠶已經(jīng)登錄的全部成熟miRNA序列。利用當(dāng)前應(yīng)用比較廣泛的2個生物信息學(xué)預(yù)測軟件RNAhybrid[12，13]（http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/）和RNA22[14]（http：//cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html）進(jìn)行靶位點(diǎn)的預(yù)測，并將二者的預(yù)測結(jié)果結(jié)合起來，根據(jù)mfe的高低以及在種子區(qū)2～8個堿基互補(bǔ)配對的情況，篩選可能與家蠶SGF-1作用的miRNAs。

1.2.2 候選家蠶miRNAs的克隆與鑒定 分別提取家蠶幼蟲期5齡3 d的中后部絲腺總RNA。以miRNAs反轉(zhuǎn)錄引物（RT Primer）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR。RT Primer的設(shè)計(jì)[15]：在通用的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列后面加上6個miRNA的反向互補(bǔ)序列；PCR引物的設(shè)計(jì)：正向引物為miRNA序列的前14個堿基，并在該序列前加上4個堿基使Tm值維持在65 ℃左右，反向引物為miRNA通用引物（表1）。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，共34個循環(huán)；72 ℃ 10 min。設(shè)U6為內(nèi)參基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)4 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。回收片段大小為80 bp左右的條帶，連接至pMDl8-T載體，16 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)化至E.coli DH10B，重組質(zhì)粒酶切鑒定正確后進(jìn)行測序。

1.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 利用Oligo 6.0設(shè)計(jì)pri-miR-305*、pri-miR-3327*和SGF-1 3′UTR的引物。引物序列如表2所示，下劃線標(biāo)記部分：caagctt、ggatcc、tctaga、ggccggcc分別為HindⅢ、BamHⅠ、XbaⅠ、FseⅠ限制性酶切位點(diǎn)。重組載體T-pri-miRNAs和pcDNA3 [ie1-egfp-SV40]分別用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ進(jìn)行雙酶切，將目的片段回收后連接到線性化的pcDNA3[ie1-egfp-SV40]上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pcDNA3[ie1-egfp-miRNA-SV40]。重組載體T-SGF-1-3′UTR和PGL3[A3-luc-SV40]分別用Xba Ⅰ和Fse Ⅰ進(jìn)行雙酶切，將目的片段回收后連接到線性化的PGL3[A3-luc-SV40]上，構(gòu)建重組表達(dá)載體PGL3[A3-luc-SGF-1 3′UTR-SV40]。

1.2.4 BmN細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 將pcDNA3 [ie1-egfp-SV40]、pGL3 [A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]、pcDNA3.0 [ie1-egfp-pri-miRNAs-SV40]、miRNA inhibitors和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-CMV分成3組分別進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。第1組包含pGL3 [A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]、pcDNA3.0 [ie1-egfp-SV40]和pRL-CMV3種質(zhì)粒；第2組包含pGL3 [A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]、pcDNA3.0 [ie1-egfp-pri-miRNAs-SV40和pRL-CMV3種質(zhì)粒；第3組包含pGL3[A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]、pcDNA3.0 [ie1-egfp-pri-miRNAs-SV40]、miRNAs inhibitor和pRL-CMV4種質(zhì)粒。每組的質(zhì)粒濃度稀釋至200 ng/μL并按1 ∶ 1的比例混合。

轉(zhuǎn)染方法按照文獻(xiàn)[16-17]描述的方法進(jìn)行：將2 μL/3 μL的上述質(zhì)?；旌衔锖? μL的Cellfectin reagent分別加入到 50 μL unsupplemented（不含胎牛血清和抗生素）TC-100培養(yǎng)基中；將二者輕輕混勻，室溫下孵育20 min；吸去12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中帶血清的完全培養(yǎng)基（細(xì)胞密度為每個35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)盤中細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0×106～ 1.5×106個），并用unsupplemented TC-100培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次；將溫育后的混合物加入到清洗后的BmN細(xì)胞中，于27 ℃恒溫箱中轉(zhuǎn)染 5 h；除去轉(zhuǎn)染液，加入完全培養(yǎng)基于27 ℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后進(jìn)行熒光素酶活性檢測。

1.2.5 熒光素酶活性檢測 熒光素酶活性的檢測按照Promega試劑盒雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)操作手冊進(jìn)行：轉(zhuǎn)染48 h后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液；每孔中加入250 μL 1× Passive Lysis buffer（1 × PLB），使細(xì)胞充分裂解；將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)到1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心30 s，吸取上清至新的1.5 mL離心管中；取4 μL細(xì)胞裂解液加入含有20 μL Luciferase Assay Reagent Ⅱ（LAR Ⅱ）的檢測管中混勻，檢測管放入Promega熒光素酶檢測儀（20/20 n Luminometer，Turner BioSystems）中，開始檢測螢火蟲熒光；加入20 μL Stop&GloTM，檢測海參熒光，記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選家蠶miRNAs的序列獲得及特征分析

SGF-1基因的3′UTR序列由1 986個堿基組成，為了篩選獲得與其3′UTR序列匹配的miRNAs，首先在miRBase數(shù)據(jù)庫下載已收錄的所有家蠶miRNAs，然后利用靶基因在線預(yù)測軟件RNAhybrid和RNA22，與SGF-1基因的3′UTR序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)20個miRNAs與SGF-1基因3′UTR序列匹配度較高；種子序列區(qū)的匹配堿基個數(shù)為5、6、7 nt的miRNAs個數(shù)分別為3、6、11個（表3）。利用比較基因組學(xué)的方法，在miRNAs二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上對這20個候選miRNAs進(jìn)行一系列的特征分析。特殊位置核苷酸偏好程度上可以看出11個55% miRNAs成熟體的5′端首位為尿嘧啶核苷酸 （U），表明該核苷酸在成熟體miRNAs的產(chǎn)生和調(diào)控過程中具有重要的意義。這20個候選miRNAs前體的長度變化范圍為73 ～ 148 nt，平均（102.9 ± 21.0） nt。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)還可看出12個miRNAs位于前體miRNAs的5′端，其余8個位于3′端（表3）。利用Altuvia等的方法[18]對20個候選miRNAs的位置進(jìn)行分析，并在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中找到4個miRNA簇，分別是：bmo-mir-1a/bmo-mir-1b；bmo-mir-305/bmo-mir-305*/bmo-mir-275；bmo-mir-2731-1/bmo-mir-2731-2；bmo-mir-3362/bmo-mir-3363。

2.2 候選家蠶miRNAs的克隆與鑒定

提取家蠶幼蟲期5齡3 d絲腺的總RNA，分別以成熟體miRNAs的莖環(huán)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，目的條帶在60～80 bp，經(jīng)凝膠電泳結(jié)果顯示，共有17個成熟體miRNAs的條帶大小符合。將目的片段回收后測序，比對結(jié)果顯示僅有bmo-miR-1a、bmo-miR-305*、bmo-miR-2731-1/-2、bmo-miR-2775a和bmo-miR-3327*的序列與數(shù)據(jù)庫中提供的數(shù)據(jù)相符（圖1），表明這6個miRNAs在家蠶幼蟲期5齡3 d表達(dá)。

2.3 候選miRNAs重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

分別構(gòu)建包含候選miRNAs前體序列bmo-pri-miR-1a、bmo-pri-miR-305*、bmo-pri-miR-2731-1、bmo-pri-miR-2731-2、bmo-pri-miR-2775a和bmo-pri-miR-3327*的重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞并檢測綠色熒光。將重組質(zhì)粒pGL3 [A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]、重組質(zhì)粒pcDNA3.0 [ie1-egfp-pri-miRNAs-SV40]、miRNA inhibitors和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-CMV分別共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，每組進(jìn)行3次重復(fù)。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行熒光檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的BmNf細(xì)胞均能檢測到綠色熒光（圖2）。

2.4 bmo-miR-305*和bmo-miR-3327*對SGF-1基因表達(dá)的調(diào)控作用

轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行熒光素酶活性測定，利用螢火蟲熒光強(qiáng)度值/海參熒光強(qiáng)度值（Luc/Rlu）對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。

結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了bmo-miR-305*重組質(zhì)粒組的luc熒光素酶活性與未轉(zhuǎn)染時(shí)比較出現(xiàn)了明顯下調(diào)（圖3-A），且2組之間差異極顯著（P<0.01），即轉(zhuǎn)染了bmo-miR-305*表達(dá)載體的這組細(xì)胞中，靶基因重組質(zhì)粒的luc熒光蛋白表達(dá)量降低了76.04%。利用人工合成bmo-miR-305* inhibitor進(jìn)一步檢驗(yàn)miRNA功能，發(fā)現(xiàn)SGF-1 3′-UTR重組質(zhì)粒熒光蛋白表達(dá)量上調(diào)（P<0.05）。由此可見，SGF-1 3′-UTR上存在bmo-miR-305*的結(jié)合位點(diǎn)，且bmo-miR-305*對SGF-1的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)具有一定的抑制作用。

轉(zhuǎn)染了bmo-miR-3327*重組質(zhì)粒組的luc熒光素酶活性與未轉(zhuǎn)染時(shí)比較出現(xiàn)了明顯下調(diào)（圖3-B），且兩組之間差異極顯著（P<0.01），即轉(zhuǎn)染了bmo-miR-3327*表達(dá)載體的這組細(xì)胞中，靶基因重組質(zhì)粒的luc熒光蛋白表達(dá)量降低了79.17%，并在轉(zhuǎn)染inhibitor后升高（P<0.05）?？梢酝茰y，bmo-miR-3327*對SGF-1的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)具有抑制功能。

3 討論與結(jié)論

應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測軟件來預(yù)測家蠶miRNAs是常用的候選miRNAs獲得方法。RNAhybrid是Rehmsmeier等和Kruger等基于miRNA和靶基因二聚體二級結(jié)構(gòu)開發(fā)的miRNA靶基因預(yù)測軟件[12-13]，屬于第一代靶基因預(yù)測軟件，RNAhybrid無需考慮靶基因的物種保守性，預(yù)測出的miRNAs的數(shù)目不多，這是本研究選用該方法的原因之一。RNA22是Miranda等開發(fā)的miRNA靶基因預(yù)測軟件[14]，是第二代靶基因預(yù)測軟件。結(jié)合上述2款預(yù)測軟件對可能作用于靶基因SGF-1的miRNAs進(jìn)行分析，共得到20個候選miRNAs。

特殊位置核苷酸偏好程度上可以看出20個候選miRNAs成熟體中，一半以上數(shù)量的miRNAs 5′端第1位為U，這與Cao等對miRNAs特征分析的結(jié)果[19]一致，在其試驗(yàn)中，成熟體miRNAs 5′端第1位為U的概率為70.73%?？赡芤舱f明了在成熟體miRNAs的產(chǎn)生和調(diào)控過程中尿嘧啶核苷酸具有重要的意義。

Liu等在Solexa sequencing測序后發(fā)現(xiàn)bmo-miR-275/bmo-miR-305/bmo-miR-305*是成簇存在的，但不同組織中的表達(dá)不同[20]。He等檢測已識別家蠶基因組中miRNAs的位置，同樣發(fā)現(xiàn)了長度為208 bp 的該miRNAs簇，且在果蠅（Drosophila melanogaster）、擬暗果蠅（D.pseudoobscura）和岡比亞蚊（Anopheles gambiae）中也有發(fā)現(xiàn)[21]。bmo-miR-275和bmo-miR-305屬于不同的miRNAs家族（mir-275家族和mir-305家族），而這2個miRNAs家族的功能未知。

近年來，越來越多的科研人員選擇雙報(bào)告基因檢測系統(tǒng)研究miRNAs的功能。黃勇利用該檢測系統(tǒng)將Fib-L 3′UTR重組質(zhì)粒和miRNAs表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Sf細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)pA3-miRNA-965、pA3-miRNA-1926能夠下調(diào)靶基因Fib-L的表達(dá)[22]。Chen等利用luc表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證了bmo-miR-1a-3p可能具有很強(qiáng)的抑制作用，且通過結(jié)合3′UTR下調(diào)BmVMP23[23]。宋菲等初步驗(yàn)證了bmo-miR-2739對Fib-H具有正調(diào)控作用[24]。同樣，尹紀(jì)云、孫鋒、劉立會、Jiang等也各自利用該檢測系統(tǒng)體外驗(yàn)證了家蠶miRNAs的功能[25-28]。在前人研究的基礎(chǔ)之上，筆者構(gòu)建了pcDNA3 [ie1-egfp-pri-mir-305-SV40]和pcDNA3 [ie1-egfp-pri-mir-3327-SV40]重組載體，并與pGL3[A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞系，驗(yàn)證了重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率和luc熒光蛋白表達(dá)活性，并發(fā)現(xiàn)miRNAs重組質(zhì)粒極顯著地抑制了luc表達(dá)（P<0.01）。該方法簡單易行，但也不能夠完全模擬體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下特異miRNAs與靶基因之間的相互作用，因此還需在個體水平進(jìn)一步研究候選miRNAs對絲腺細(xì)胞因子基因SGF-1表達(dá)的調(diào)控作用。

本研究中，對靶基因SGF-1 3′UTR進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，因?yàn)閯游镏谐Ｒ姷膍iRNAs作用機(jī)制是與靶基因mRNA的3′UTR結(jié)合后抑制其翻譯，但并不對其進(jìn)行剪切或降解。隨著miRNAs研究的豐富，研究人員不但發(fā)現(xiàn)了一些新型miRNAs的正調(diào)控作用和去抑制作用[29-30]，還發(fā)現(xiàn)有些miRNAs能結(jié)合靶基因5′UTR，且能夠促進(jìn)靶基因的表達(dá)或翻譯[31]，而這也為今后在更加廣闊的領(lǐng)域中研究家蠶miRNAs功能打下基礎(chǔ)。家蠶miRNAs功能研究中，靶基因5′UTR結(jié)合位點(diǎn)以及功能的研究尚未有報(bào)道，這對于絲腺細(xì)胞因子調(diào)控機(jī)制的深入研究也有一定的啟發(fā)?；蛟S在不久的將來，我們還會發(fā)現(xiàn)更多關(guān)于miRNAs和絲腺細(xì)胞因子之間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，也為探討家蠶miRNAs、絲腺細(xì)胞因子和蠶絲蛋白基因間的調(diào)控機(jī)理提供新的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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