摘 要：通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究苦參堿對(duì)人胃癌細(xì)胞株（SGC-7901）及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV-304） 增殖活性的影響，進(jìn)而研究苦參堿的抗腫瘤活性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)胃癌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并用不同濃度的苦參堿對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行處理、觀察，采用MTT比色法、生長(zhǎng)曲線法比較這兩種細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示：苦參堿對(duì)于人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）具有明顯的抑制作用，加藥后的第一天開(kāi)始人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）增殖受到抑制，細(xì)胞數(shù)量減少，而對(duì)ECV-304抑制作用不明顯，說(shuō)明苦參堿對(duì)腫瘤血管作用較弱，主要通過(guò)抑制胃癌細(xì)胞增殖而實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤作用。

關(guān)鍵詞：胃癌 苦參堿 細(xì)胞增殖

基金項(xiàng)目：哈爾濱商業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃國(guó)家級(jí)項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)201410240006.

由于全球自然環(huán)境的惡化，人們生活作息的改變，惡性腫瘤的發(fā)病率逐年升高，因惡性腫瘤而引起的死亡人數(shù)居所有疾病死亡人數(shù)的第二位，僅次于心腦血管疾病。在全世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤中，胃癌則最為常見(jiàn)。在中國(guó)，其發(fā)病率以及死亡率均占全部惡性腫瘤之首?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)苦參堿具有鎮(zhèn)痛，強(qiáng)心，抗心律失常，抗病毒，抗炎，抗腫瘤，消腫利尿，免疫抑制和抗菌殺蟲(chóng)等廣泛的藥理活性。因而在臨床上被廣泛應(yīng)用，苦參堿的濃度和作用時(shí)間不同，對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡具有不同的影響。藥物濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，都會(huì)增加細(xì)胞凋亡的幾率。本實(shí)驗(yàn)采用不同時(shí)間、不同劑量的苦參堿研究其對(duì)胃癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，對(duì)進(jìn)一步研究苦參堿的抗腫瘤活性及機(jī)制具有一定的指導(dǎo)意義。

1、實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

苦參堿（純度≥99%）購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自Invitrogen公司；溴化四氮唑藍(lán)（MTT），臺(tái)盼蘭購(gòu)自Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO）分析純購(gòu)自天津市博迪化工有限公司。

1.2 細(xì)胞株

人胃癌細(xì)胞株 （SGC-7901），人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（ECV304）哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院保存。

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT比色實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人胃癌細(xì)胞SGC-7901及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304用PBS漂洗2次，去除漂浮在培養(yǎng)基中的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶室溫消化，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞的濃度為5×104個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液加到96孔板中，每孔加入100μl細(xì)胞懸液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。將苦參堿以每孔100μl的體積加入到預(yù)先設(shè)計(jì)好的96孔板中，終濃度梯度為0μg·ml-1，100μg·ml-1，200μg·ml-1，400μg·ml-1，800μg·ml-1，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照孔加入同等體積的不含血清的培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h后，各孔加入10μl濃度為5mg·ml-1的MTT，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄含有MTT的細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100μl二甲基亞砜（DMSO）溶液（避光）。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為490nm下測(cè)定96孔板每孔的吸光度值。取平均值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=各給藥組吸光度值/空白對(duì)照組吸光度值×100%。

2.2 生長(zhǎng)曲線

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌細(xì)胞SGC-7901及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304用PBS漂洗2次，去除漂浮在培養(yǎng)基中的細(xì)胞，然后加入適量濃度為0.25%胰蛋白酶室溫消化，調(diào)整細(xì)胞的濃度為5×104個(gè)/ml。向24孔板加入制備好的細(xì)胞懸液，每孔加入400μl細(xì)胞懸液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。吸棄舊培養(yǎng)液，各孔重新加入培養(yǎng)液。細(xì)胞分兩組，對(duì)照組各孔加400μl無(wú)血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組各孔加濃度為500μg·ml-1的苦參堿400μl，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。取出24孔板，每天對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組各取3個(gè)孔，在超凈工作臺(tái)中用PBS漂洗2次，在加入0.25%胰蛋白酶充分消化后，細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9：1混合混勻。（終濃度0.04%），光鏡下計(jì)數(shù)。分別多次計(jì)數(shù)求平均值，持續(xù)計(jì)數(shù)6天。

3、分析與討論

近年來(lái)，我國(guó)腫瘤疾病尤其是胃癌的發(fā)病率和死亡率均在急劇增加，尋找到合適的藥物來(lái)解決這一問(wèn)題是迫在眉睫的?？鄥A作為從植物中提取的天然藥物，存在副作用小的優(yōu)勢(shì)，從而使得苦參堿備受矚目，關(guān)于它的研究也越來(lái)越多。研究表明，苦參堿在很多方面表現(xiàn)出了生物活性和藥理作用，其在抗腫瘤活性方面表現(xiàn)尤為突出，因此本文對(duì)該藥物在抗腫瘤體外活性方面做出了研究。

本實(shí)驗(yàn)研究目的是探究苦參堿對(duì)胃癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的影響，因此選取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 （ECV-304）和人胃癌細(xì)胞 （SGC-7901） 作為研究對(duì)象，采用MTT法和細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的方法進(jìn)行研究。

MTT結(jié)果顯示在加入苦參堿48h后，不同濃度的實(shí)驗(yàn)組OD值有明顯的差異，隨著濃度的增加，OD值逐漸降低，這說(shuō)明苦參堿能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 （ECV-304）及人胃癌細(xì)胞 （SGC-7901），并且呈劑量依賴性?？鄥A對(duì)于人胃癌細(xì)胞 （SGC-7901）及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 （ECV-304）的IC50值分別為763μg·ml-1、1888μg·ml-1。藥物對(duì)SGC-7901的IC50值小，且對(duì)ECV-304的IC50值最大，顯示出苦參堿對(duì)人胃癌細(xì)胞的抑制增殖作用相對(duì)較強(qiáng)，對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞影響較弱。

綜上所述， 苦參堿可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖?？鄥A對(duì)人胃癌細(xì)胞的作用強(qiáng)，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞作用較弱，并隨藥物濃度和用藥時(shí)間不同其抗腫瘤作用不同，同時(shí)進(jìn)一步說(shuō)明苦參堿對(duì)人體非腫瘤細(xì)胞的影響較弱，顯示出了苦參堿的獨(dú)特的抗腫瘤作用優(yōu)勢(shì)，這對(duì)未來(lái)對(duì)腫瘤的治療具有一定的指導(dǎo)意義。

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（作者單位：哈爾濱商業(yè)大學(xué) 黑龍江哈爾濱市 150076）