馮偉旭

哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠 150000

復(fù)方丹參片中非法添加的三七莖葉的檢測(cè)探究

馮偉旭

哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠 150000

目的：為了檢測(cè)復(fù)方丹參片中是否添加了三七莖葉，建立檢測(cè)三七莖葉的方法。方法：用薄層色譜（TCL）的方法進(jìn)行檢查，使用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：薄層色譜法與高效液相色譜法結(jié)果一致。結(jié)論：使用的這兩種方法都比較準(zhǔn)確、檢驗(yàn)效率高、可重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以使用這兩種方法進(jìn)行復(fù)方丹參片中非法添加的三七莖葉的檢測(cè)。

復(fù)方丹參片；非法添加；三七莖葉；檢測(cè)研究

復(fù)方丹參片是治療心血管病經(jīng)常使用的處方藥，這種復(fù)方丹參片中的成分有三七、丹參、冰片。三七是比較傳統(tǒng)的珍貴藥材，是經(jīng)過多年成長的草本植物，三七并不是所有的部分都要入藥，只有根和根莖可以入藥，三七根是非常難得到的資源，與三七根相似的是三七莖葉，三七莖葉比三七根更容易得到，在價(jià)格上也就相對(duì)便宜，而且不易區(qū)分，這一特點(diǎn)就給一些不法分子可乘之機(jī)，使用三七莖葉來制作復(fù)方丹參片，因此，要使用薄層色譜法對(duì)復(fù)方丹參片中是否加入三七莖葉進(jìn)行判斷，用高效液相色譜法進(jìn)行驗(yàn)證。

一、儀器與試藥

Agilent1200型高效液相色譜儀；Millipore超純水器；CamagReprostar3型薄層數(shù)碼成像系統(tǒng)；薄層硅膠G板（煙臺(tái)工業(yè)研究所）；乙腈（色譜純），水（超純水），其余試劑為分析純；三七對(duì)照藥材（批號(hào)為120941－200304），三七莖葉皂苷對(duì)照品（批號(hào)為0781－200201），三七皂苷R1對(duì)照品（批號(hào)為0745－200109），人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)為 110703－200726），人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)為110704－200420），人參皂苷Rb3對(duì)照品（批號(hào)為111686－200501）均由中國藥品生物制品檢定所提供；復(fù)方丹參片（A廠，批號(hào)為C8A032；B廠，批號(hào)070817；C廠，批號(hào)為8121177；D廠，批號(hào)為070501；E廠，批號(hào)為071003；F廠，批號(hào)為080322）。

二、方法與結(jié)果

（一）薄層色譜法

取復(fù)方丹參片5片，將丹參片的包衣除去，將里面的藥碾碎，在碾碎的藥中加入140mL乙醚，進(jìn)行5min的超聲處理，使用甲醇－水－冰醋酸，比例是46∶54∶1，ZorbaxSB－C18柱（250mm ×4.6mm，5μm），因?yàn)檫@種色譜柱的分離度好，保存的時(shí)間也比較適中，因此選擇這種色譜柱。

試驗(yàn)中考察了流動(dòng)相甲醇－水－冰醋酸，比例是50∶50∶1，乙腈（0.2%）—磷酸溶液，20∶80、甲醇－水－冰醋酸（46∶54∶1）對(duì)供試品預(yù)測(cè)定峰分離度的影響，其中流動(dòng)相甲醇－水－冰醋酸（46∶54∶1）分離度好，保留一定的時(shí)間，在試品預(yù)測(cè)峰出峰后，在60min內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)雜質(zhì)峰，這樣會(huì)對(duì)樣品的測(cè)試產(chǎn)生影響，為了不對(duì)樣品的測(cè)試有影響，因此要采用梯度洗脫的方法。

將碾碎的丹參片用溶劑濾，溶劑蒸發(fā)，藥渣加甲醇 25mL，加熱回流15min，放冷，將濾液蒸干，把殘?jiān)铀?5mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇25mL振搖提取，取正丁醇提取液，用氨試液25mL洗滌，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次25mL，正丁醇液濃縮至干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液；另取三七對(duì)照藥材0.5g，同法制成對(duì)照藥材溶液；再取三七皂苷R1對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品、人參皂苷Rg1對(duì)照品、三七莖葉皂分別加甲醇制成每1mL含三七皂苷R11mg、人參皂苷Rb11mg、人參皂苷Rg11mg、三七莖葉10mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述6種溶液各1～3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇－醋酸－水（4∶1∶5）放置分層的上層溶液為展開劑展開，展距15cm以上，將其取出，晾干，在上面噴上硫酸乙醇溶液（1→10），110℃下加熱直到斑點(diǎn)出現(xiàn)的更加的清晰。在與三七莖葉皂苷對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯示不一致的斑點(diǎn)（E，F(xiàn)）；樣品6，9色譜圖中，在與三七莖葉皂苷對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯示完全一致的斑點(diǎn)。說明樣品5，78，10，11不含三七莖葉皂苷，而樣品6，9含三七莖葉皂苷。

（二）高效液相色譜法

1.色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，按規(guī)定洗脫，檢測(cè)波長為203nm。

2.溶液制備

溶液制備取人參皂苷Rb3對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成1g/L的溶液；取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品及三七皂苷R1對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含人參皂苷Rg10.25mg、人參皂苷Rb10.30mg及三七皂苷R10.05mg的混合對(duì)照品溶液。取本品20片，除去包衣，研細(xì)，取約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇 25mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率480W，頻率40kHz）30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

3.測(cè)定法

分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL，注入到液相色譜儀里就可以了。經(jīng)過測(cè)定法進(jìn)行測(cè)試，薄層色譜法沒有檢測(cè)出復(fù)方丹參片里含有三七莖葉的成分，但是使用高效液相色譜法就檢測(cè)出了人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1，沒有出現(xiàn)人參皂苷Rb3，與三七藥材的高效液相色譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果是一致的。

4.結(jié)果

使用薄層色譜法沒有檢測(cè)出三七莖葉皂苷的成分，使用高效液相色譜法也沒有出現(xiàn)人參皂苷Rg1及三七皂苷R1對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的色譜峰，有與人參皂苷 Rb1對(duì)照品的色譜峰保留的時(shí)間相同，但峰高較三七藥材低，有與人參皂苷Rb3對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰，這與三七莖葉高效液相色譜圖一致。如圖所示：

圖1 高效液相色譜圖

三、討論

對(duì)于是否在復(fù)方丹參片中摻加三七莖葉的檢測(cè)，主要是使用三七莖葉皂苷作為對(duì)比物的，如果檢查出來的斑點(diǎn)與三七莖葉皂苷一致，那么檢查結(jié)果就是復(fù)方丹參片里含有三七莖葉的成分，這時(shí)復(fù)方丹參片就是不合格產(chǎn)品。這次試驗(yàn)采用的是高效液相色譜法，是利用三七莖葉中的三七莖葉皂苷人參皂苷Rb3，通過實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與薄層色譜法是一致的，這種現(xiàn)象說明三七莖葉皂苷的檢出率與重現(xiàn)性非常好，利用這種方法檢測(cè)復(fù)方丹參片中是否含有三七莖葉成分是合理的。

復(fù)方丹參片的主要成分中使用的是三七根或者根莖，但是三七的根是很難得到的，因?yàn)槿咝枰荛L的生長年限才能使用，這時(shí)三七的藥用效果才比較好，因此三七的根千金難求。這時(shí)很多不法分子就想出了使用相似藥物三七莖葉來充當(dāng)三七的根，三七莖葉的價(jià)格便宜，容易獲得，使現(xiàn)在很多的復(fù)方丹參片中都有三七莖葉成分，因此醫(yī)學(xué)研究者研究出了薄層色譜法來進(jìn)行三七莖葉的研究，三七莖葉的的主要成分就是三七莖葉皂苷，因此就是對(duì)三七莖葉皂苷的檢測(cè)，用高效液相色譜法進(jìn)行進(jìn)行檢測(cè)，先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，兩者結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加的準(zhǔn)確，這種方法是可行的。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:527.

[2]劉，韓金玉，常賀英，等.三七莖葉提取物中人參皂苷Rb3的分離指紋圖譜[J].天津大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，39（10）:1151.

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