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（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，哈爾濱150028）

高效液相色譜法測定嬰幼兒食品和乳品中葉黃素

張麗宏,宋戈,亢美娟

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，哈爾濱150028）

建立了高效液相色譜法測定嬰幼兒食品和乳品中葉黃素的方法。樣品通過70℃皂化10m in，釋放出葉黃素，正己烷萃取，濃縮后甲醇溶解定容，以甲醇為流動相，經(jīng)C18色譜柱分離，用紫外檢測器于445 nm波長處檢測?；厥章试?6.0%～102.0%，精密度(RSD)為1.95%～3.78%，檢出限分別為0.02μg/g。該方法操作簡單，精密度好，準(zhǔn)確性高，經(jīng)濟(jì)環(huán)保。

葉黃素；嬰幼兒食品；乳品；高效液相色譜

0 引 言

葉黃素屬于胡蘿卜醇一類的色素，具有重要的生理活性，有抗氧化、抗衰老等功能，另外對視網(wǎng)膜中的黃斑有重要保護(hù)作用。由于葉黃素人體不能自身合成，只能從食物中攝取，國內(nèi)外出現(xiàn)了添加葉黃素的強(qiáng)化食品。近幾年，國內(nèi)外對葉黃素檢測研究的文獻(xiàn)有很多[1-6]，但都不適用嬰幼兒食品和乳品中葉黃素的測定。奶粉中葉黃素檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)[7]和有關(guān)文獻(xiàn)報道的方法[8-9]中樣品前處理中采用直接提取，而在實(shí)際樣品中添加的葉黃素原料經(jīng)微囊化處理，不易直接提取，而且所用萃取劑容易把其他胡蘿卜醇類物質(zhì)提取出來給測定帶來干擾。

本研究通過優(yōu)化的皂化條件把樣品中的葉黃素完全游離釋放，用合理的萃取劑進(jìn)行提取，建立嬰幼兒食品和乳品中葉黃素的檢測方法，準(zhǔn)確簡單。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器設(shè)備

Waters1525高效液相色譜儀配Waters2487紫外檢測器；氮吹儀；Q L-901型振蕩器。

1.2 色譜條件

葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.0mg,用無水乙醇定容至10m L容量瓶中,搖勻，配成1.000 g·L-1標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，儲藏于-40℃，使用時按需要制成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液；甲醇為色譜純；正己烷；無水乙醇；氫氧化鉀；抗壞血酸；實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水；以上試劑除標(biāo)注的外均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6mm，5 m），柱溫為30℃；檢測器為紫外檢測器；測定波長為445 nm；流動相為甲醇；流速為1.0m L/m in。

1.3.2 樣品處理

調(diào)味奶、酸奶和乳飲料：直接吸取1 m L,雪糕、冰激淋：融化后吸取1 m L，移入10 m L帶螺旋蓋的試管稱量；果泥、果醬和嬰幼兒配方乳粉：稱取0.1 g,移入10 m L帶螺旋蓋的試管，加入30℃左右水1 m L振蕩溶解；面包和嬰幼兒配方米粉：稱取2 g移入三角瓶中，加入0.2 g淀粉酶和30℃左右水20 m L,充氮密封后37℃酶解30 m in，吸取1 m L移入10 m L帶螺旋蓋的試管。然后向樣品中加入約0.1 g抗壞血酸和1m L無水乙醇，混勻，再加入0.5 m L 50%氫氧化鉀水溶液,在70℃水浴中皂化10 m in，涼水冷卻后加入正己烷3 m L，用振蕩器振蕩萃取1 m in，萃取3次，合并萃取液，在40℃下用氮吹儀吹干，加入1 m L甲醇定容，振蕩完全溶解殘留物，在-18℃冷凍30 m in，0.45μm濾膜過濾,供分析測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 皂化條件的選擇

檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與前處理的好壞直接相關(guān)，而在本試驗(yàn)中前處理的好壞關(guān)鍵在于皂化條件選擇的是否合理。好的皂化條件應(yīng)該滿足既能把被測物完全從樣品中釋放出來，又能保證被測物被破壞的風(fēng)險最低，損失最小。選擇同一個均勻的樣品，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。皂化時都加入0.5 m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%氫氧化鉀溶液和皂化10 m in，在不同溫度下皂化，得到皂化溫度與測定結(jié)果的關(guān)系圖如圖1(a)，可以確定70℃是最佳皂化溫度。在同一皂化溫度70℃下，都加入0.5 m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%氫氧化鉀溶液后，皂化不同的時間，得到皂化時間與測定結(jié)果的關(guān)系圖如圖1（b）,可以確定在70℃皂化溫度下，皂化10 m in最佳。在同一皂化溫度70℃下，皂化相同的時間10 m in，加入不同量的堿，得到加入堿的量與測定結(jié)果的關(guān)系圖如圖1（c）,可以確定在70℃皂化溫度下，皂化10 m in時，加入堿的量為0.5 m L 50%氫氧化鉀溶液時最佳。在皂化溫度低、皂化時間短或加入堿的量少時皂化不完全，被測物不能全部從樣品中游離出來，而皂化溫度過高、皂化時間過長或加入堿的量過多被測物就會被氧化，損失了。另外通過實(shí)驗(yàn)對比皂化樣品和不造皂化樣品兩種前處理，對添加游離葉黃素醇的樣品，檢測結(jié)果沒有區(qū)別，但對添加經(jīng)微囊化處理的葉黃素醇酯類的樣品，經(jīng)過皂化前處理的檢測結(jié)果更接近添加的理論值。故最終選擇加入0.5 m L 50%氫氧化鉀溶液，70℃皂化溫度，皂化10m in的皂化條件。

圖1 皂化溫度、皂化時間和堿的添加量對測定結(jié)果的影響

2.2 萃取劑的選擇

被測物完全從樣品中釋放出來后，選擇一種恰當(dāng)?shù)娜軇┌驯粶y物全部提取出來才能保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。選取3種提取溶劑正己烷、石油醚、乙醚，對同一個均勻樣品進(jìn)行萃取。用正己烷作為萃取劑時，分層效果好，濃縮吹干定容后，殘留物能容易全部溶解，檢測結(jié)果也最高；其他的提取溶劑在萃取時不易分層，把其他脂溶性維生素也提取出來了，濃縮吹干定容后，有殘留物不溶解。而能溶解葉黃素的氯仿和乙醇，沸點(diǎn)高不適合作提取溶劑，故確定正己烷為萃取劑。

2.3 色譜條件的選擇

要保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，好的分離條件也必不可少。與反相C18柱相比，C30柱有更好的分離能力，對分離類胡蘿卜素具有明顯的優(yōu)勢，但價格是C18柱的3到4倍，而且在分離被測物時要用到甲基叔丁基醚，氣味大，對環(huán)境和人都有毒害。樣品經(jīng)過皂化，正己烷萃取后，得到的分析液雜質(zhì)少，除葉黃素外其他類胡蘿卜素沒有被提取出來，干擾小，標(biāo)準(zhǔn)樣品、樣品和空白樣品色譜圖如圖2～圖4所示。用反相C18柱，甲醇作流動相，進(jìn)行分離完全能達(dá)到分析要求。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

分別配制質(zhì)量濃度為0.001，0.005，0.05，0.1，1.0，10.0，20.0，50.0m g/L的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳色譜條件下，進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定，得到葉黃素回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍，并以3倍信噪比時的進(jìn)樣濃度計算出了檢出限如表1所示。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜

圖3 樣品的色譜

圖4 空白樣品的色譜

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍和檢出限

2.5 回收率和精密度

以同一個空白樣品為實(shí)驗(yàn)材料，加入一定量的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，平行測定8次，得出精密度并以平均測定值計算回收率，結(jié)果如表2所示。

表2 葉黃素回收率和精密度（n=8）

由此可見，測定結(jié)果的較為穩(wěn)定，方法的重復(fù)性較好。

2.6 樣品測定

按試驗(yàn)方法對樣品進(jìn)行測定，結(jié)果如表3所示。

表3 樣品測定結(jié)果

3 結(jié) 論

本文重點(diǎn)研究了皂化條件及萃取劑對分析測定的影響，建立了高效液相色譜法測定嬰兒配方食品和乳品中葉黃素的方法。該方法測定結(jié)果重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，簡單易操作，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，適合用于葉黃素的日常檢測。

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Determination of lutein in foods for infants and dairy products by high-performance liquid chromatographic

ZHANG Li-hong,SONG Ge,KANG Mei-juan
(National Dairy Testing Center,Northeast Agriculture University,Harbin 150028,China)

A simple and rapid method for determination of lutein in foods for infants and dairy products by high-performance liquid chromatography(HPLC)was developed.Following a mild saponi cation procedure(70℃for 10min)demonstrated to be benign to lutein,lipophilic components were partitioned by a single extraction into hexane and concentrated in mobile phase.Separation of lutein was achieved using a C18 column and isocratic elution with methanol and detected at445 nm with a ultraviolet detector.The recovery were 96.0%～102.0%,the relative standard deviations(RSD)were 1.95%～3.78%,the minimum detectable values were 0.02μg/g.This method can be used for the routine analysis of lutein.

lutein;foods for infants;dairy products;HPLC

TS252.7

：A

：1001-2230（2016）02-0047-03

2015-09-15

張麗宏（1975-），女，工程師，從事乳制品檢測與研究。