程龍鳳，王藹明*，付鑫，趙勇，徐祥波，賀斌*

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院，合肥　230032；2. 中國人民解放軍海軍總醫(yī)院，北京　100048；3. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，通遼　028000;4. 國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京　100081)

?

不同劑量的雌激素對大鼠子宮內(nèi)膜機(jī)械損傷后修復(fù)的影響

程龍鳳1，2，王藹明1，2*，付鑫2，3，趙勇2，徐祥波4，賀斌4*

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院，合肥230032；2. 中國人民解放軍海軍總醫(yī)院，北京100048；3. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，通遼028000;4. 國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京100081)

【摘要】目的本研究旨在探討不同劑量的雌激素對大鼠子宮內(nèi)膜機(jī)械損傷后修復(fù)的影響。方法選擇動情期Wistar雌鼠50只，隨機(jī)分為正常對照組、損傷組、損傷+10 μg雌激素組、損傷+100 μg雌激素組。除正常對照組外，對各組大鼠左側(cè)宮腔進(jìn)行機(jī)械搔刮，搔刮后立即皮下注射17 β-雌二醇，劑量分別為0 μg/100 μl、10 μg/100 μl、100 μg/100 μl，連續(xù)7 d。損傷后21 d合籠交配，見栓后5.5 d通過HE染色觀察各組子宮內(nèi)膜形態(tài)改變，免疫組織化學(xué)觀察各組間容受相關(guān)分子整合素αvβ3、白血病抑制因子(LIF)的表達(dá)情況，觀察見栓后7 d各組間兩側(cè)子宮著床點(diǎn)個數(shù)。結(jié)果(1)孕5.5 d，HE染色可見損傷組和損傷+100 μg雌激素組腺體數(shù)目明顯減少，實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少，纖維化面積較大；正常對照組和損傷+10 μg雌激素組腺體豐富，實(shí)質(zhì)細(xì)胞多。(2)免疫組織化學(xué)染色可見：損傷各組與正常對照組比較，內(nèi)膜αvβ3、LIF表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；損傷+10 μg組與損傷組、損傷+100 μg組比較，αvβ3、LIF表達(dá)量顯著增多(P<0.05)；損傷組與損傷+100 μg組比較，αvβ3表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)，LIF表達(dá)量顯著減少(P<0.05)。(3)孕7 d，與正常對照組及各組自身對照側(cè)比較，損傷各組損傷側(cè)著床點(diǎn)個數(shù)顯著減少(P<0.01)；損傷各組間比較，損傷+10 μg組著床個數(shù)較損傷組、損傷+100 μg組稍增多，但無顯著性差異(P>0.05)；損傷+100 μg組與損傷組比較，著床個數(shù)相當(dāng)，無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論機(jī)械損傷后，子宮內(nèi)膜在自然修復(fù)情況下不僅存在形態(tài)結(jié)構(gòu)差異，且容受功能出現(xiàn)明顯下降；外源性雌激素干預(yù)可在一定程度上促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)，改善子宮內(nèi)膜容受功能，其中10 μg劑量(相當(dāng)于大鼠生理劑量)效果最佳，大劑量的雌激素可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性的下降。

【關(guān)鍵詞】機(jī)械損傷；子宮內(nèi)膜容受性；雌二醇；大鼠

(JReprodMed2016，25(4)：353-359)

正常月經(jīng)周期中，內(nèi)膜功能層的修復(fù)依賴基底層細(xì)胞以及腺上皮細(xì)胞的再生，但是在病理情況下，內(nèi)膜基底層損傷，功能層再生不足，活性內(nèi)膜喪失，影響生殖預(yù)后。導(dǎo)致子宮內(nèi)膜損傷的主要因素是不恰當(dāng)?shù)膶m腔內(nèi)操作[1]，損傷后的內(nèi)膜易形成粘連或纖維化。宮腔鏡下粘連分解術(shù)是現(xiàn)今臨床主要的治療手段[2]，然而粘連在術(shù)后容易復(fù)發(fā)，成為制約生殖預(yù)后的瓶頸。雌激素序貫療法是臨床上較為普遍采用的術(shù)后輔助治療手段之一[3]，但其用法用量尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。且關(guān)于雌激素能否改善損傷后的內(nèi)膜容受功能，目前相關(guān)研究較少，其作用仍存在爭議。本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠宮腔內(nèi)機(jī)械損傷模型的基礎(chǔ)上，通過受孕觀察損傷后大鼠子宮內(nèi)膜容受性的改變，并使用不同劑量的外源性雌激素干預(yù)，探討雌激素對損傷后子宮內(nèi)膜容受功能的影響，為臨床上子宮內(nèi)膜損傷患者的個體化輔助治療提供前期動物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物及試劑

1. 實(shí)驗(yàn)動物：9～10周齡的Wistar大鼠(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)，體重約220～250 g，飼養(yǎng)于國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所SPF級實(shí)驗(yàn)動物屏障系統(tǒng)。環(huán)境溫度20～22℃，相對濕度70%～85%，每日光照及黑暗刺激各12 h，自由攝食、水。雌雄分籠飼養(yǎng)。

2. 主要試劑：免疫組化一抗兔抗大鼠αvβ3、白血病抑制因子(LIF)均購自北京博奧森生物有限公司，批號分別為bs-0086R、bs-1058R；二抗(兔二步法檢測試劑盒)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(批號：PV6001)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(批號：ZLI9032)；山羊血清購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(批號：ZLI9021)。

3. 17β-雌二醇試劑的配制：稱取一定量的17β-雌二醇粉劑(Alfa Aesar，英國)，使用定量的無水乙醇將17β-雌二醇充分溶解后，加入定量的無菌花生油配制成1 mg/ml的母液，置于渦旋機(jī)上混勻15 min。在無菌超凈工作臺上抽吸一定量的母液，添加無菌花生油，配制成濃度為10 μg/100 μl及100 μg/100 μl的雌二醇備用。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 分組：通過陰道細(xì)胞涂片選擇動情期雌鼠50只，隨機(jī)分為：A組(正常對照組，n=11只)，無任何干預(yù)；B組(損傷組，n=13只)：建立大鼠單側(cè)宮腔機(jī)械損傷模型；C組(損傷+10 μg雌激素組，n=13只)，損傷后立即皮下注射17β-雌二醇10 μg/100 μl，以后每日晨9時皮下注射雌二醇油溶液，連續(xù)7 d；D組(損傷+100 μg雌激素組，n=13只)，損傷后立即皮下注射17β-雌二醇100 μg/100 μl，以后每日晨9時皮下注射雌二醇油溶液，連續(xù)7 d。

2. 大鼠子宮內(nèi)膜損傷模型的建立：根據(jù)本研究組前期實(shí)驗(yàn)研究方法，使用2.5%戊巴比妥鈉(sigma，美國)腹腔注射對大鼠進(jìn)行麻醉，具體劑量按200 μl/100 μg給予。麻醉后的大鼠，經(jīng)左側(cè)背部切口，逐層分離組織，進(jìn)入腹腔后在背部脂肪團(tuán)周圍找到子宮，并提拉出腹腔，注意保護(hù)卵巢及周圍血管；于子宮遠(yuǎn)端(近卵巢側(cè))剪一直徑約0.2 cm小口，根據(jù)大鼠子宮粗細(xì)大小，選擇相應(yīng)型號的自制刮勺進(jìn)行搔刮，搔刮長度自切口起約為1～1.5 cm，力度以不穿透子宮為宜，直至刮出大量內(nèi)膜且自覺宮腔粗糙；以4號絲線縫合子宮切口，關(guān)腹，縫合皮膚，碘伏棉球消毒傷口。右側(cè)子宮剪開后，不予搔刮，立即縫合子宮，其后操作同左側(cè)。手術(shù)當(dāng)日記為第1天。損傷側(cè)建模過程由同一位宮腔內(nèi)操作術(shù)者進(jìn)行，以保證模型一致性。

3. 取材及處理：各組大鼠于手術(shù)日后第21天與雄鼠1∶1合籠交配。每日清晨檢查陰道栓，見栓者記為孕第0.5天，至孕5.5 d時斷頸處死大鼠，每組5只。處死后立即剖腹取子宮組織，剔除脂肪及結(jié)締組織后，剪取手術(shù)損傷段及對側(cè)未損傷段組織置于4%多聚甲醛中固定24 h以上，常規(guī)石蠟包埋，切片。各組剩余大鼠于孕7 d斷頸處死后打開腹腔，記錄著床胚胎數(shù)并拍照。

4. 組織染色及圖像分析：(1)HE染色：子宮橫切片脫蠟、水化，蘇木精染色液中3 min，1%鹽酸酒精分化片刻，沖水1 min；1%氨水中返藍(lán)，伊紅染色液染色5 min，沖水，脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察并拍照。(2)免疫組織化學(xué)染色：子宮橫切片脫蠟、水化、采用枸櫞酸鹽緩沖液煮沸方式進(jìn)行抗原修復(fù)。室溫下將組織切片置于3%H2O2中20 min，PBS洗滌，切片加5%山羊血清置37℃孵育20 min，隨后滴加一抗αvβ3(1∶1 600)或LIF(1∶3 200)，4℃過夜。隨后，滴加二抗于37℃孵育30 min，DAB顯色和蘇木素復(fù)染后，脫水透明，中性樹膠封片。隨機(jī)選取4個視野，以深棕色為陽性信號，電子顯微鏡(Leica，德國)下拍照。采用醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus 6.0)分別測量αvβ3、LIF陽性染色區(qū)域面積，并利用軟件計算其與子宮內(nèi)膜面積比。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

一、孕5.5 d子宮內(nèi)膜組織HE染色結(jié)果

各組大鼠孕5.5 d子宮橫切面HE染色后可見：正常對照組：內(nèi)膜腺體開口豐富，實(shí)質(zhì)細(xì)胞多；損傷組：內(nèi)膜中腺體數(shù)量少，基質(zhì)纖維化面積大，實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少；損傷+10 μg雌激素組：腺體開口較豐富，腺上皮細(xì)胞排列較整齊，基質(zhì)纖維化程度較輕，實(shí)質(zhì)細(xì)胞較多；損傷+100 μg雌激素組：宮腔面積尚存，腺體數(shù)量較損傷組稍多，纖維化面積仍較大(圖1)。

二、孕5.5 d子宮內(nèi)膜組織免疫組僅化學(xué)染色結(jié)果

1. 整合素αvβ3的表達(dá)：正常對照組：αvβ3于內(nèi)膜腺上皮胞質(zhì)及胞漿中表達(dá)，圍繞宮腔分布，且延伸至內(nèi)膜內(nèi)1/2；損傷組：表達(dá)量顯著較少，分布稀疏，僅表達(dá)在內(nèi)膜淺層；損傷+10 μg雌激素組：αvβ3于內(nèi)膜淺至中層(未及內(nèi)膜1/2)及腺體周圍表達(dá)；損傷+100 μg雌激素組：表達(dá)量較少，且分布于內(nèi)膜淺層。

1A、1B為正常對照組;1C、1D為損傷組;1E、1F為損傷+10 μg E2組;1G、1H為損傷+100 μg E2組圖1　各組大鼠孕5.5 d子宮橫切面　HE染色 ×400

2A、2B為正常對照組;2C、2D為損傷組;2E、2F為損傷+10 μg E2組;2G、2H為損傷+100 μg E2組圖2　整合素αvβ3和LIF在孕5.5 d子宮內(nèi)膜的定位表達(dá)　免疫組織化學(xué)染色　×400

2. LIF的表達(dá)：正常對照組：LIF表達(dá)于子宮內(nèi)腔上皮細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞的胞漿和胞核中，分布均勻，排列致密；損傷組：表達(dá)量顯著減少，基質(zhì)中分布稀疏；損傷+10 μg雌激素組：LIF表達(dá)于內(nèi)膜淺至中層，分布較均勻；損傷+100 μg雌激素組：LIF僅表達(dá)于腺上皮淺層，基質(zhì)中呈少量散在分布(圖2、3，表1)。

圖3　各組子宮內(nèi)膜整合素αvβ3、LIF的表達(dá)面積

組 別例數(shù)整合素αvβ3LIF正常對照組517.5±5.3*22.4±4.7*損傷組58.2±1.39.7±1.6損傷+10μg雌激素組512.1±2.1#13.6±2.4#損傷+100μg雌激素組56.7±1.66.7±1.1**

注：與其它各組比較，*P<0.05；與損傷組、損傷+100 μg組比較，#P<0.05；與損傷組比較，**P<0.05

三、孕7 d胚胎著床點(diǎn)情況

大鼠正常胚胎于孕7 d前后完成著床過程，肉眼觀察可見宮腔內(nèi)突起的光滑小結(jié)節(jié)(圖4)。正常對照組左右兩側(cè)著床數(shù)相當(dāng)，分布均勻，大小均一。各組大鼠未損傷側(cè)(右側(cè))著床個數(shù)比較，無顯著性差異(P>0.05)；損傷各組損傷側(cè)著床點(diǎn)個數(shù)較正常對照組顯著減少(P<0.01)。損傷各組間比較，損傷+10 μg組著床個數(shù)較損傷組、損傷+100 μg組稍增多，但無顯著性差異(P>0.05)；損傷+100 μg組較損傷組比較，著床點(diǎn)個數(shù)略增加，但亦無顯著性差異(P>0.05)，可能與實(shí)驗(yàn)例數(shù)較少有關(guān)(表2)。

*損傷區(qū)域；#非損傷區(qū)域；R為右側(cè)圖4　肉眼觀察各組大鼠孕7 d雙側(cè)子宮胚胎著床情況4A：正常對照組4B：損傷組　4C：損傷+10 μg組　4D：損傷+100 μg組

組 別例數(shù)對照側(cè)平均著床個數(shù)損傷側(cè)損傷區(qū)域(左上側(cè))損傷側(cè)非損傷區(qū)域(左下側(cè))可見著床點(diǎn)的大鼠(只)平均著床個數(shù)可見著床點(diǎn)的大鼠(只)平均著床個數(shù)正常對照組58.4±1.5/8.6±1.8(右/左)----損傷組88.8±1.75(62.5)1.0±0.7*8(100.0)2.2±0.3*損傷+10μg組88.4±1.26(75.0)1.0±0.9*8(100.0)2.5±0.8*損傷+100μg組88.2±1.66(75.0)0.9±0.8*8(100.0)2.3±1.0*

注：與正常對照組及各組自身對照側(cè)比較，*P<0.01

討論

生理情況下，子宮內(nèi)膜伴隨卵巢激素水平改變，發(fā)生周期性增殖與脫落，體內(nèi)產(chǎn)生的雌激素在卵泡期促進(jìn)子宮內(nèi)膜增殖。然而在內(nèi)膜病理損傷的情況下，雌激素作為宮腔鏡粘連分解術(shù)后預(yù)防宮腔粘連再發(fā)生的常用手段之一，對內(nèi)膜修復(fù)的作用仍然存在爭議。子宮內(nèi)膜病理性損傷是臨床常見的導(dǎo)致育齡婦女不孕的原因之一。大部分情況下，損傷后的子宮內(nèi)膜在自然修復(fù)過程中伴隨著腺體、上皮不完全再生，膠原纖維增生等，不僅發(fā)生形態(tài)改變，也涉及內(nèi)膜的容受功能改變。目前，評估子宮內(nèi)膜功能的方法有限，容受性相關(guān)細(xì)胞分子常常用來評價內(nèi)膜對胚胎的容受功能。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)M臨床刮宮操作，建立大鼠子宮內(nèi)膜機(jī)械損傷模型，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行不同劑量的雌激素干預(yù)。結(jié)果顯示，正常對照組和損傷+10 μg雌激素組腺體開口較損傷組和損傷+100 μg雌激素組數(shù)量多，實(shí)質(zhì)細(xì)胞豐富，纖維化面積小?？隙舜萍に貙?nèi)膜病理損傷后增殖修復(fù)的促進(jìn)作用，但本實(shí)驗(yàn)中較大劑量(100 μg)雌激素干預(yù)后的內(nèi)膜形態(tài)與損傷后未干預(yù)組比較，內(nèi)膜形態(tài)上無明顯差異，且在平均著床數(shù)目上略少于其余各組，提示雌激素在劑量上的應(yīng)用仍需進(jìn)一步探討。

此外，胚胎植入過程需要多種因子的參與，胚胎本身與子宮內(nèi)膜的交流主要通過整合素來完成[4]。整合素是一類細(xì)胞粘附分子，表達(dá)于細(xì)胞膜，并通過結(jié)合相應(yīng)的配體(骨橋蛋白等)發(fā)揮生物學(xué)功能。胚胎和內(nèi)膜表達(dá)的整合素可識別并結(jié)合骨橋蛋白，促進(jìn)胚胎與內(nèi)膜的粘附[5]。在種植窗口期，由于雌二醇調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和生長因子的分泌，子宮內(nèi)膜中整合素的表達(dá)顯著增高，使得內(nèi)膜容受功能最大化。此外，整合素可以增加血管通透性，促進(jìn)局部血管的擴(kuò)張，參與子宮內(nèi)膜蛻膜化，這些都有益于胚胎與內(nèi)膜的粘附。眾多研究表明，在人類和其他動物模型中，胚胎種植期整合素αvβ3的表達(dá)顯著增高[6-10]。參與調(diào)解子宮內(nèi)膜功能的細(xì)胞因子還有LIF、白介素-6(IL-6)、白介素-1(IL-1)等。其中，作為IL-6家族成員的LIF，是對胚胎植入起到關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子之一[11]。早在1991年，Bhatt等[12]就證實(shí)了子宮內(nèi)膜中LIF是啟動胚胎著床必須的細(xì)胞因子。LIF基因突變的雌性小鼠雖可以正常排卵，受精卵發(fā)育可至胚泡階段，但在著床期胚泡游離于宮腔不能植入[13]。研究發(fā)現(xiàn)在不孕婦女的子宮內(nèi)膜中，LIF的表達(dá)顯著減少[14]。且有研究認(rèn)為LIF的表達(dá)數(shù)量可以預(yù)測生殖預(yù)后[15]。

本研究在大鼠子宮內(nèi)膜機(jī)械損傷后不給予或給予不同劑量的雌激素干預(yù)，結(jié)果顯示，在無雌激素和大劑量雌激素干預(yù)情況下，受損的子宮內(nèi)膜在胚胎植入時整合素αvβ3和LIF表達(dá)明顯減少，且分布相對局限，僅表達(dá)在內(nèi)膜淺層，提示子宮內(nèi)膜在機(jī)械損傷后，不僅存在內(nèi)膜形態(tài)的改變，例如腺體數(shù)量減少，纖維化面積增多，而且容受功能也出現(xiàn)一定程度的下降，損傷后的子宮內(nèi)膜即使通過體內(nèi)激素生理周期的調(diào)節(jié)，其功能仍然存在一定缺陷。有研究報道，10 μg外源性雌激素用于去勢大鼠后，體內(nèi)雌激素水平約相當(dāng)于大鼠動情期生理雌激素水平[16-17]。本研究結(jié)果中給予10 μg雌激素干預(yù)后，子宮內(nèi)膜整合素αvβ3的表達(dá)較未干預(yù)組增多，分布均勻；LIF的表達(dá)也明顯改善，陽性細(xì)胞數(shù)量增多，分布至內(nèi)膜淺中層。提示與生理水平相當(dāng)?shù)耐庠葱源萍に乜筛纳谱訉m內(nèi)膜損傷后的內(nèi)膜容受功能，但仍不能恢復(fù)至正常。100 μg外源性雌激素干預(yù)后，整合素αvβ3的表達(dá)較損傷干預(yù)組減少，且分布較稀疏，LIF的表達(dá)相似，提示過高的雌激素水平也可能降低子宮內(nèi)膜容受性。林洪波等[18]的研究發(fā)現(xiàn)雌激素水平在一定范圍內(nèi)時，與LIF表達(dá)呈正相關(guān)，隨著雌激素水平的升高，LIF表達(dá)增加，但超過一定濃度時，反而呈負(fù)相關(guān)，即過高的雌激素導(dǎo)致LIF表達(dá)水平的下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符。

臨床工作中，我們常常使用外源性雌激素來誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜發(fā)育、改善子宮內(nèi)膜容受性，為胚胎移植做內(nèi)膜準(zhǔn)備，但其具體用法用量尚不統(tǒng)一[17，19]。在大鼠中，見栓后的第7天已完成胚胎植入[20]，肉眼可見子宮內(nèi)面突起白色小結(jié)節(jié)。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜損傷大鼠損傷側(cè)較對照側(cè)著床個數(shù)顯著減少，提示機(jī)械損傷后子宮內(nèi)膜容受功能下降，與孕5.5 d容受相關(guān)因子的表達(dá)變化相一致。不同組間比較，10 μg雌激素組損傷側(cè)宮腔出現(xiàn)著床的大鼠只數(shù)較損傷后未干預(yù)組損傷側(cè)出現(xiàn)著床的大鼠只數(shù)稍增多。除正常對照組外，余各組間大鼠著床個數(shù)比較無顯著性差異，結(jié)果可能與實(shí)驗(yàn)例數(shù)較少有關(guān)。外源性10 μg 17-β 雌二醇在大鼠體內(nèi)可升高血清雌激素至相當(dāng)于大鼠動情期生理水平[21]，因此推測，臨床治療中，給予人體生理劑量相當(dāng)?shù)耐庠葱源萍に馗深A(yù)，可能對子宮內(nèi)膜修復(fù)的效果最佳。

綜上所述，本研究觀察了雌激素對大鼠子宮內(nèi)膜損傷后功能修復(fù)的影響，包括種植窗口期整合素αvβ3、LIF的表達(dá)以及成功植入的胚胎個數(shù)，初步評估了子宮內(nèi)膜病理損傷后自然修復(fù)能力以及雌激素干預(yù)對子宮內(nèi)膜修復(fù)的影響，認(rèn)為生理劑量的外源性雌激素可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜近期及遠(yuǎn)期修復(fù)，而大劑量的雌激素并無益于子宮內(nèi)膜損傷后的改善。本研究旨在為后期在模型基礎(chǔ)上實(shí)施預(yù)防及治療提供參考，以期為指導(dǎo)臨床治療提供思路。但由于本研究所采用的大鼠子宮內(nèi)膜損傷模型與人類子宮內(nèi)膜之間尚存在種屬來源及結(jié)構(gòu)功能的差異，蛋白表達(dá)機(jī)制的差異以及如何觀察胚胎本身對子宮內(nèi)膜功能的影響等問題還有待于進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1]March CM. Management of Asherman’s syndrome[J/OL]. Reprod Biomed Online，2011，23：63-76.

[2]March CM. Asherman’s syndrome[J]. Semin Reprod Med，2011，29：83-94.

[3]Tonguc EA，Var T，Yilmaz N，et al. Intrauterine device or estrogen treatment after hysteroscopic uterine septum resection[J]. Int J Gynaecol Obstet，2010，109：226-229.

[4]徐慧穎，李娜，張云山. 胚胎植入-子宮內(nèi)膜容受性是關(guān)鍵[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志，2014，23：198-202.

[5]Lessey BA，Castelbaum AJ. Integrins and implantation in the human[J]. Rev Endocr Metab Disord，2002，3：107-117.

[6]Lessey BA，Castelbaum AJ，Buck CA，et al. Further characterization of endometrial integrins during the menstrual cycle and in pregnancy[J]. Fertil Steril，1994，62：497-506.

[7]Fazleabas AT，Bell SC，F(xiàn)leming S，et al. Distribution of integrins and the extracellular matrix proteins in the baboon endometrium during the menstrual cycle and early pregnancy[J]. Biol Reprod，1997，56：348-356.

[8]Damario MA，Lesnick TG，Lessey BA，et al. Endometrial markers of uterine receptivity utilizing the donor oocyte model[J]. Hum Reprod，2001，16：1893-1899.

[9]Illera MJ，Lorenzo PL，Gui YT，et al. A role for alphavbeta3 integrin during implantation in the rabbit model[J]. Biol Reprod，2003，68：766-771.

[10]Cheng JG，Rodriguez CI，Stewart CL. Control of uterine receptivity and embryo implantation by steroid hormone regulation of LIF production and LIF receptor activity：towards a molecular understanding of “the window of implantation”[J]. Rev Endocr Metab Disord，2002，3：119-126.

[11]Paiva P，Menkhorst E，Salamonsen L，et al. Leukemia inhibitory factor and interleukin-11：critical regulators in the establishment of pregnancy[J]. Cytokine Growth Factor Rev，2009，20：319-328.

[12]Bhatt H，Brunet LJ，Stewart CL. Uterine expression of leukemia inhibitory factor coincides with the onset of blastocyst implantation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，1991，88：11408-11412.

[13]Stewart CL，Kaspar P，Brunet LJ，et al. Blastocyst implantation depends on maternal expression of leukaemia inhibitory factor[J]. Nature，1992，359：76-79.

[14]Seli E，Kayisli UA，Cakmak H，et al. Removal of hydrosalpinges increases endometrial leukaemia inhibitory factor (LIF) expression at the time of the implantation window[J]. Hum Reprod，2005，20：3012-3017.

[15]Mikolajczyk M，Wirstlein P，Skrzypczak J. The impact of leukemia inhibitory factor in uterine flushing on the reproductive potential of infertile women--a prospective study[J]. Am J Reprod Immunol，2007，58：65-74.

[16]Russo LA，Peano BJ，Trivedi SP，et al. Regulated expression of matrix metalloproteinases，inflammatory mediators，and endometrial matrix remodeling by 17beta-estradiol in the immature rat uterus[J]. Reprod Biol Endocrinol，2009，7：124.

[17]Fielder EP，Guzick DS，Guido R，et al. Adhesion formation from release of dermoid contents in the peritoneal cavity and effect of copious lavage：a prospective，randomized，blinded，controlled study in a rabbit model[J]. Fertil Steril，1996，65：852-859.

[18]林洪波，龐厚清，汪燕，等. 超排卵著床期小鼠子宮內(nèi)膜LIF表達(dá)與雌孕激素的關(guān)系[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2009，11：39-43.

[19]鄭嶸，王燕，吳維. 中重度宮腔粘連術(shù)后應(yīng)用不同劑量雌激素對預(yù)后的影響[J]. 公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，25：118-120.

[20]Schlafke S，Enders AC. Cytological changes during cleavage and blastocyst formation in the rat[J]. J Anat，1967，102：13-32.

[21]Gibbs RB. Fluctuations in relative levels of choline acetyltransferase mRNA in different regions of the rat basal forebrain across the estrous cycle：effects of estrogen and progesterone[J]. J Neurosci，1996，16：1049-1055.

[編輯：肖曉輝]

Effect of different doses of estradiol on endometrium repair after mechanical injury in rat

CHENGLong-feng1，2，WANGAi-ming1，2*，F(xiàn)UXin2，3，ZHAOYong2，XUXiang-bo4，HEBin4*

1.AnhuiMedicalUniversity，Hefei230032 2.NavyGeneralHospital，Beijing100048 3.InnerMongoliaUniversityFortheNationalitiesCollegeofClinicalMedicine，InnerMongolia，Tongliao028000 4.ReproductivePhysiologyLaboratory，NationResearchInstituteforFamilyPlanning，Beijing

100081

【Abstract】

Objective： To evaluate the effect of different doses of estradiol on endometrium repair after mechanical injury in rat.

Methods： Fifty Wistar female rats were randomly divided into four groups：control group，endometrium injury group，injury+10 μg estradiol group and injury+100 μg estradiol group. The left side of uterine cavity of all rats except the control group was received mechanical scratching. 17-beta estradiol at doses of 0 μg，10 μg，and 100 μg in 100 μl solvent was subcutaneously injected once daily for 7 consecutive days after scratched. After 21 days of injury，all the female rats were mated with male rats. Then the endometrial morphological changes by HE staining and the markers related endometrial receptivity including integrin αvβ3 and interleukin (LIF)by immunohistochemistry staining were observed on the 5.5thday of pregnancy，and counted the number of embryos on both sides of uterine on the 7thday.

Results： On the 5.5thdays of pregnancy，HE staining showed that the numbers of gland and parenchymal cells were decreased，and the fibrosis area was enlarged in the injury group or the injury+100 μg estradiol group. Gland and parenchymal cells were abundant in the control group or the injury+10 μg estradiol group. Immunohistochemistry staining showed that the expressions of integrin αvβ3 and LIF were significantly decreased in all injury groups than those in the control group (P<0.05). Among the three injury groups，the expressions of integrin αvβ3 and LIF in the injury+10 μg group were significantly higher than those in the injury group or the injury+100 μg estradiol group (P<0.05). The LIF expression was significantly decreased in the injury group than that in the injury+100 μg estradiol group (P<0.05)，while the expression of integrin αvβ3 was not significantly different (P>0.05).Compared with the control group or self-control side，the numbers of embryos in all the injury groups were significantly reduced on the 7thday of pregnancy(P<0.01). The numbers of embryos were not significantly different among the three injury groups(P>0.05).

Conclusions： Endometrium presents not only morphological changes，but also significantly decreases in receptivity undergoing natural repair after mechanical injury. An appropriate amount of exogenous estradiol can promote endometrium repair and improve the endometrial receptivity. The best effect was at a dose of 10 μg，and high dose of estradiol may lead to decline of endometrial receptivity in rats.

Key words：Mechanical Injury；Endometrial receptivity；Estradiol；Rat

【作者簡介】程龍鳳，女，安徽合肥人，在讀碩士生，生殖內(nèi)分泌專業(yè).((* )通訊作者，Email：王藹明 one_army@sina.com；賀斌 hebox@263.net)

【基金項目】國家“十二五”科技支撐計劃項目(2012BAI32B05)；國家自然科學(xué)基金項目(81370703)

【收稿日期】2015-08-17；【修回日期】2015-11-23

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.04.012